轮状病毒由于其丰富的遗传多样性而在全球范围内构成了巨大威胁。该病毒分为A-J十个组,能在地球上所有物种中广泛传播,如可在哺乳动物和鸟类中引起严重的腹泻和肠胃炎,因而其防控受到高度重视。在中国和其他国家均有大量的研究报告表明,牛轮状病毒（BRV）是导致牛腹泻的首要病原体,可以单独或与其他病毒/病原体共同引起腹泻。然而,科学研究的空白点仍很多,如该病的确切流行率、导致发病的具体基因型及其发病机制等。本研究旨在阐明与犊牛腹泻相关的BRV在中国的流行情况,分离和鉴定优势毒株,并在细胞miRNA水平和小鼠水平证实其致病性。主要研究结果总结如下。1.腹泻犊牛粪样中BRV的检测、分离和鉴定在2016-2021年期间,从中国不同地区的肉牛场和奶牛场收集了427份严重腹泻犊牛（1周-24周龄）的粪便样本。利用针对牛轮状病毒VP6基因保守区的RT-PCR,从427个粪便样本中共检测出155个牛轮状病毒阳性样本,总体患病率为36.3%,但具有地区差异。其中,东北、华北、华中、西南、西北和华东地区患病率分别为58.3%、40.7%、37.4%、36.8%、32.8%和20.0%。由于未能直接从临床样本中通过PCR或高通量测序对牛轮状病毒进行完整基因组特征鉴定和基因分型,继续利用MA-104细胞系增殖和分离病毒。经历多次盲传（最多十次）直到出现轮状病毒的典型细胞病变效应（CPE）,同时通过RT-PCR确认病毒的存在。最终获得的病毒分离物滴度可达到104.5 TCID50/50μl。利用RT-PCR和SDS—RNA-PAGE两种方法同时确认收获的无细胞和细胞相关病毒为牛轮状病毒,进一步根据SDS—RNA-PAGE显示的RNA片段迁移模式,证实分离到A组和B组牛轮状病毒。利用ESI-LC-MS/MS对病毒全蛋白测序,确定了两株A组轮状病毒（RVA）和一株B组牛轮状病毒（RVB）,分别为:RVA/Cow-tc/CHN/35333/2019/G6P[5]、RVA/Cow-tc/CHN/10927/2019/G8P[7]和（RVB/Cow-tc/CHN/35334/2019/G5P[3]）,其基因型分别是:（G6-P[5]-I2-R2-C2-M2-A3-N2-T6-E2-H3）、（G8-P[7]-I5-R1-C1-M2-A1-N1-T1-E1-H1）和（G5-P[3]-I3-R5-C5-A5-N4-H5）。对所获得的序列进行系统发育分析表明,所分离的毒株与以前报道的某些毒株相同,但与其他毒株不同,如出现少量点缺失、插入或替换突变。G6和P[5]基因型与巴西牛轮状病毒毒株蛋白质氨基酸序列具有100%同源性,而G8和P[7]A组牛轮状病毒在中国是首次报道,其蛋白序列与南韩牛轮状病毒毒株具有100%氨基酸同源性;同时,B组牛轮状病毒在中国是首次报道,与印度牛轮状病毒毒株的基因型相同。这些新毒株的分离鉴定为研究中国犊牛轮状病毒相关腹泻的发病机制、研发新型疫苗和其他控制措施奠定了基础。2.BRV诱导感染细胞致病相关miRNA反应的研究鉴定BRV诱导感染细胞致病相关的miRNA反应,对阐明BRV的发病机制和研发更有效的防控措施具有重要意义。到目前为止,尚无报道涉及BRV感染MA-104细胞的miRNAs反应。因此,我们对BRV G8P[7]感染和未感染的MA-104细胞后不同时间点（0 hpi、6 hpi、12 hpi、24 hpi、36 hpi和48 hpi）的miRNA文库进行Illumina RNA测序,从BRV感染的和未感染的细胞中分别获得了74701041和74184124个干净测序数据（clean reads）,其中579个为已知miRNAs,144个为新miRNAs。与未感染MA-104相比,BRV感染细胞中有160个差异表达（DE）miRNAs,其中95个上调,65个下调。利用生物信息学分析预测了DE miRNAs的靶标m RNAs,通过GO和KEGG分析对靶基因进行了功能注释,结果表明:所富集的通路主要与生物途径、内吞作用、凋亡过程、跨高尔基体膜和溶酶体功能有关。此外,m TOR（mml-mi R-486-3p和mml-mi R-197-3p）、NF-κB（mml-mi R-204-3p,novel＿366）、Rap 1（mml-mi R-127-3p）、c AMP（mml-mi R-106b-3p）、MAPK（mml-mi R-342-5p）、T细胞受体信号通路（mml-mi R-369-5p）、RIG-I样受体信号通路（mml-mi R-504-5p）、AMPK（mml-mi R-365-1-5p）、PI3K-Akt（mml-mi R-299-3p）等信号通路也被富集。利用实时荧光定量PCR（q PCR）对所选择的23个DE miRNAs的表达进行了验证,其结果与深度测序结果一致。其所预测的28个靶标m RNAs主要涉及细胞机制和免疫调控相关的途径,并验证了其中mml-mi R-99a-5p对BRV复制的影响,确定在感染的前六小时内能上调病毒复制。综上,该研究首次发现BRV感染对MA-104细胞miRNA表达的影响以及诱导的差异miRNA对BRV复制的影响,为抗病毒药物或疫苗研发提供了潜在靶标。3.BRV分离株对小鼠的致病性利用新生小鼠模型评估RVA G8P[7]型分离株的毒力。在感染后的前6天,接种和未接种小鼠均未表现明显的腹泻症状或任何其他临床症状。然而,在接种后的第7天,与未接种小鼠相比,10/12的接种小鼠粪便变软。通过q PCR在粪便中检测到病毒。病理组织学观察表明,与未接种的对照鼠相比,感染后10天的小鼠的小肠和肝脏结构出现病理变化,包括细胞萎缩和坏死等,证明病毒对小鼠具有致病作用。综上所述,本论文确定了中国腹泻犊牛的轮状病毒流行率,分离鉴定了2株A组牛轮状病毒和1株B组牛轮状病毒,其中BRVA G8P[7]型和BRVB在中国为首次报道;并首次初步确定了BRVA G8P[7]型感染诱导MA-104细胞的致病相关miRNAs反应。这些结果为中国犊牛腹泻新型防控措施的研发和牛轮状病毒致病机制的深入研究奠定了基础。