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猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）引起猪的一种高度接触性、致死性传染病,是世界动物卫生组织（OIE）要求必须申报的动物烈性传染病之一,我国将其列为一类动物传染病。猪瘟临床上以高热稽留,免疫抑制,和繁殖障碍为主要特征。CSFV是黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus）的成员,是具有囊膜的单股正链RNA病毒。CSFV的囊膜糖蛋白有Erns、E1和E2,其中E2蛋白位于病毒囊膜的表面,是CSFV重要的毒力因子和主要的保护性抗原,参与病毒对宿主细胞的感染。目前,对于CSFV E2蛋白在病毒入侵宿主细胞过程中所发挥作用的研究较少,且基于E2蛋白的CSF亚单位疫苗在CSF防控中扮演举足轻重的作用。为开展对E2蛋白诊断应用和病毒入侵宿主细胞的研究,我们建立了分泌型稳定高效表达CSFV E2蛋白的悬浮细胞系并对其功能活性进行了初步的研究。根据GenBank中收录的CSFV JL1（06）株基因序列设计特异性引物,以pcDNA-E2（ED）-Flag质粒为模板,利用融合RT-PCR技术获得羧基端带有Flag和Strep标签的E2蛋白胞外区（ectodomain,ED）的基因片段,命名为E2（ED）-Flag/Strep,接着将其克隆至慢病毒表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1中,获得的重组质粒命名为pLVX-E2（ED）-Flag/Strep。利用辅助质粒与该重组质粒共转293T细胞包装慢病毒并对贴壁CHO细胞及悬浮293细胞进行转导,通过有限稀释法、ELISA、SDS-PAGE及western blot筛选及鉴定贴壁CHO阳性细胞克隆,命名为CHO/E2。通过流式细胞术筛选悬浮293阳性细胞克隆,命名为293s/E2。分别纯化两种细胞系上清中的E2蛋白,BCA法测定浓度后显示,293s/E2细胞系培养上清中E2蛋白的表达量要远高于CHO/E2细胞系。因此我们接下来用293s/E2细胞系进行下一步的研究。收集连续传代的细胞培养上清,用超滤管浓缩并用StrepTactin纯化分泌至上清中的E2蛋白,经SDS-PAGE及western blot检测,结果显示,E2蛋白在重组细胞系中可以分泌的形式稳定表达至至少第20代,在培养上清中蛋白产量可达10.87μg/mL。将纯化后的E2蛋白免疫新西兰大白兔后,能够诱导宿主产生较高的抗体水平,CSFV中和抗体滴度可达1:3200。表明293s/E2表达的重组E2蛋白具有良好的免疫原性。我们利用纯化的CSFV E2蛋白封闭PK-15细胞,接毒后检测培养上清中子代病毒的滴度结果显示CSFV E2蛋白的封闭能够显著抑制CSFV对PK-15细胞的感染。将E2蛋白与CSFV共同孵育PK-15细胞后分别在4℃吸附1h及37℃内化2h后用荧光定量PCR检测吸附及内化的病毒基因组拷贝数,结果显示,E2蛋白主要抑制了CSFV的内化对吸附没有影响。本研究构建了以分泌形式稳定高效表达E2蛋白的悬浮293细胞系293s/E2,其所表达的重组E2蛋白能够诱导家兔产生较高水平的中和抗体。利用该细胞系表达的E2蛋白,我们鉴定出,在CSFV入侵宿主细胞的过程中E2蛋白主要在病毒内化入宿主细胞阶段发挥作用,说明该蛋白具有良好的生物活性。为进一步发现与E2蛋白相互作用的受体及宿主因子、建立CSFV诊断方法奠定了基础。