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研究目的 光纤光度检测技术是一种适用于检测自由活动动物深部脑区一群神经细胞Ca2+活动的信号探测技术。本文将癫痫发生的Ca2+假说作为理论依据,旨在利用光纤光度检测技术探究自由活动小鼠在海人酸(Kainic acid,KA)诱发的小鼠急性痫性发作前、后其病灶区海马(Hippocampus,HPC)、内嗅皮层(Entorhinal cortex,EC)的钙信号,为自由活动动物这一研究水平下癫痫发生的相关研究提供新的研究方法和理论支持。研究内容 1.光纤光度检测装置的搭建与信噪比(Signal-noise ratio,SNR)优化;2.适用于光纤光度检测技术的KA急性致痫方法的筛选;3.自由活动小鼠HPC-CA3、CA1、齿状回(Dentate gyrus,DG)区和EC的痫样钙信号及其与急性痫性发作行为的关系。研究方法 1.组装与调试光纤光度检测装置,分别利用光功率计、人工散射样品和麻醉动物样品测试装置的光纤耦合效率、荧光收集效率和SNR。2.实验动物与分组:实验动物为2月龄雄性C57BL/6小鼠,用于比较不同给药方式致痫结果的动物随机分为4组:颅内KA局部给药组、颅内生理盐水对照组、全身系统给药低剂量组和全身系统给药高剂量组;用于进行钙信号记录实验的动物按照目标记录位点随机分为4组:CA3组、CA1组、DG组和EC组。3.KA诱发小鼠急性痫性发作的方法和行为学评价:颅内KA局部给药组和生理盐水对照组的动物提前行开颅手术预植入用于给药的套管,待动物从术中恢复3~5天后,在小鼠清醒状态下利用微量注射泵和注射内管在小鼠颅内给予0.5μl 2m M的KA溶液或0.5μl生理盐水;全身系统给药低剂量组和高剂量组动物分别皮下注射15mg/kg、20mg/kg剂量的KA溶液。摄录4组小鼠KA给药前30min和给药后2h的行为表现,按照改进的Racine分级法对小鼠痫性发作的严重程度进行评分,小鼠出现了Ⅰ级及以上发作即认为是被诱发了痫性发作。将Ⅲ级及以上发作称为抽搐性运动发作(Convulsive motor seizures,CMS),根据小鼠KA给药后2h内达到CMS和达到Ⅴ级发作的比例、每组动物达到CMS的平均发作次数和每次CMS的平均发作时长,评估并筛选适用于光纤光度检测技术的致痫方法。4.钙信号记录和急性痫性发作行为研究:对动物实施开颅手术后在目标记录位点微量注射Ca2+指示剂OGB-1 AM,并将光纤植入在被指示剂负载的神经细胞上方。用牙科水泥将光纤固定在小鼠颅骨上,待动物完全恢复清醒后放入行为学观察装置。利用光纤光度检测装置和钙信号记录软件记录小鼠自由活动时目标脑区KA给药前30min自发的正常钙信号和KA给药后2h内诱发的痫样钙信号,比较KA给药前、后钙信号的幅值。整个过程中同步摄录小鼠的行为表现,分析痫样钙信号与小鼠急性痫性发作行为的关系。5.钙信号分析与统计学处理方法:利用基于Lab VIEW编写的钙信号分析软件读取和分析记录到的钙信号,其幅值用△F/F表示。对筛选致痫方法研究中各组间达到CMS的发作次数和每次CMS的平均发作时长的比较进行单因素方差分析;对KA给药前、后的钙信号幅值进行配对样本的非参数检验。研究结果 1.本实验室自主搭建的光纤光度检测装置光纤耦合效率约为3%,荧光收集效率约为20%,最小SNR约为7.6d B,满足实验需求。2.KA诱发小鼠急性痫性发作的方法筛选研究中,KA局部给药组小鼠均达到CMS发作,CMS的平均发作次数为9±2.14次,每次平均发作时长为61±12.82s,且小鼠均发展为Ⅴ级发作;低剂量全身给药组动物仅有75%达到了CMS发作,CMS的平均发作次数和每次发作的平均时长分别为3±1.85次和31±8.80s,仅有25%的动物发展为Ⅴ级发作;高剂量全身给药组动物均达到CMS发作,CMS的平均发作次数为5±1.63次,每次平均发作时长为33±7.54s,有40%的小鼠发展为Ⅴ级发作。其中KA局部给药组小鼠CMS的平均发作次数以及每次CMS发作的平均时长均与全身给药组有显著的统计学差异。3.与小鼠自由活动时正常的无节律的钙信号不同,KA给药诱发的痫样钙信号主要表现出四种模式,包括钙积聚、大/小型钙波、高频脉冲样钙信号和低频脉冲样钙信号。不同模式的痫样信号无脑区特异性,但在不同脑区的组合方式有所差异,例如HPC-CA3、CA1区的钙积聚与大型钙波总是连续相伴出现,DG区的大型钙波较为平滑,EC区的高频脉冲样钙信号总是与小型钙波同步出现等。小鼠自由活动时,HPC-CA3区正常钙信号和KA诱发的痫样钙信号的平均幅值分别为1.18±0.40%和4.75±3.88%;CA1区正常钙信号的平均幅值为1.59±0.19%,KA给药后记录到的痫样钙信号平均幅值为13.88±9.78%;DG区正常钙信号和给药后痫样钙信号的平均幅值分别为1.36±0.42%和6.36±3.56%;小鼠EC正常的钙信号幅值和给药后的痫样钙信号的平均幅值分别为为2.23±0.55%和7.51±2.54%。各记录位点KA诱发的痫样钙信号平均幅值均显著高于正常钙信号的幅值。4.HPC-CA3的钙积聚信号在小鼠有点头等明显的痫性发作动作前至少提前10s出现,而EC伴随有高频脉冲样钙信号的小型钙波与小鼠的痫性发作动作同时发生。结论 光纤光度检测技术可以有效地应用于自由活动动物急性痫性发作时深部脑区(深度≥4mm)神经细胞的钙信号记录。以20mg/kg剂量进行KA皮下给药的方法适用于在钙信号记录过程中诱发小鼠急性痫性发作。在小鼠表现出CMS动作之前,KA已经造成了HPC-CA3区神经细胞的活动异常。