目的:肠神经系统（Enteric nervous system,ENS）是由肠壁内的神经元和神经胶质细胞构成的网络系统,其发育异常会引起胃肠道严重的功能紊乱或畸形,但具体调控机制尚不清楚。实验组前期研究应用蛋白质组学筛选发现在先天性巨结肠（Hirschsprung disease,HSCR）患者中核糖不均一核糖核蛋白A2B1（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2B1,hnRNPA2/B1）呈高表达。hnRNPA2/B1属于RNA结合蛋白家族的一员,主要通过影响m RNA稳定性和可变剪接发挥作用,在多种恶性肿瘤中均存在差异性表达,介导上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）参与恶性肿瘤的发生进展,但目前尚未有关肠神经系统发育调控机制的研究报道。肠神经系统发育由肠神经嵴干细胞由头端向尾端迁移、增殖分化并定植于肠道,本实验组前期实验证实EMT在大鼠肠神经嵴干细胞发育过程中发挥重要作用。EMT是胚胎发育的基础,对于机体组织和器官的分化具有至关重要的作用。ZEB家族是重要的EMT转录因子,通过结合E-钙蛋白的启动子区域,促进EMT的发生,但是HNRNPA2B1与ZEB家族的关系以及是否可以诱导EMT发生尚不清楚。因此,本研究首次在大鼠肠神经嵴干细胞（Enteric neural crest stem cells,ENCSCS）中,运用实时定量PCR（Reverse Transcription PCR,RT-PCR）、免疫印迹法（Western-Blotting,WB）、细胞增殖实验（cck-8法）、细胞凋亡实验（AV/PI流式检测法）、细胞迁移实验（transwell）等实验证实hnRNPA2/B1参与大鼠肠神经嵴干细胞发育,通过RNA免疫沉淀法（RNA-Immunoprecipitation,RIP）探讨hnRNPA2/B1介导EMT在肠神经系统发育中的调控机制。研究方法:1、ENCSCs分离培养健康成熟未孕的Wistar大鼠,按雌雄3:1比例午夜合笼,第二天上午做雌鼠阴道涂片,显微镜下观察发现精子或肉眼发现阴栓掉落,确认已交配怀孕,此日计妊娠0天（embryonic day0,E0）。取妊娠12天（embryonic day12,E12）的Wistar雌鼠,提取ENCSCS并传代培养。2、构建大鼠hnRNPA2/B1病毒载体,设计大鼠hnRNPA2/B1干扰腺病毒,qRT-PCR和WB筛选出干扰效果最佳的腺病毒进行下一步转染实验。3、运用RNA干扰技术（RNA Interfernce,RNAi）转染大鼠肠神经嵴干细胞,敲低hnRNPA2/B1表达,qRT-PCR和WB分别检测在阴性对照组与实验干扰组中EMT标志物E-钙蛋白（E-cadherin）和N-钙蛋白（N-cadherin）、EMT转录因子ZEB1/ZEB2表达情况,RT-PCR检测mir-200c的表达情况。4、利用RNAi敲低大鼠肠神经嵴干细胞中hnRNPA2/B1蛋白表达,通过CCK-8实验、AV/PI流式检测法、transwell实验,分别在阴性对照与实验干扰组中观察大鼠肠神经嵴干细胞的增殖、凋亡、迁移情况。5、在正常大鼠肠神经嵴干细胞中,运用RIP实验验证hnRNPA2/B1与EMT转录因子ZEB1/ZEB2的结合情况。6、统计分析:实验结果以平均数±标准差表示,采用Graph Pad Prism 8.0进行数据分析。结果:1、使用DMEM/F12完全培养基成功培养出妊娠12天的ENCSCs。2、共设计出2对大鼠hnRNPA2/B1干扰腺病毒,经过qRT-PCR实验,选取大鼠hnRNPA2/B1干扰腺病毒si RNA1作进一步瞬时转染,WB实验进一步证实hnRNPA2/B1干扰腺病毒si RNA1可以用于干扰hnRNPA2/B1蛋白的表达。3、运用RNA干扰技术,敲低hnRNPA2/B1蛋白表达,qRT-PCR和WB结果一致:与阴性对照组相比,实验干扰组ZEB1/ZEB2表达减少,E-cadherin和mi R-200c表达增加、N-cadherin表达减少。4、通过RNAi敲减hnRNPA2/B1蛋白表达,经qRT-PCR和WB验证:实验干扰组比阴性对照组相比,细胞增殖减慢、凋亡率下降、迁移速度减慢。5、经过RIP实验证实hnRNPA2/B1与ZEB1/ZEB2 m RNA存在直接结合。结论:我们研究结果表明,hnRNPA2/B1影响大鼠肠神经嵴干细胞的增殖、迁移、凋亡过程,并且在大鼠肠神经嵴干细胞中hnRNPA2/B1可与ZEB1/ZEB2 m RNA直接结合,可能通过影响ZEB1/ZEB2 m RNA稳定性调控EMT。提示hnRNPA2/B1参与肠神经系统发育调控。