复合酶法制备小麦胚芽多肽的生物活性研究

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本课题选择复合蛋白酶水解小麦胚芽后的得到的多肽,测定分子量分布,利用超滤膜和纳滤膜对小麦胚芽多肽进行分段和脱盐,得到不同分子量的麦胚多肽;研究麦胚多肽的生物活性,包括抗氧化活性、抗疲劳作用、降胆固醇活性等,得出具有较好生物活性的麦胚多肽片段。(1)利用凝胶过滤层析SephadexG-15来测定通过木瓜蛋白酶和中性蛋白酶复合水解麦胚蛋白得到的小麦胚芽多肽的分子量分布状况,结果显示,小麦胚芽多肽的分子量主要集中在300Da~2500Da之间,占到59%;2500Da以上的的多肽分子大约占28%;1000Da~2500Da之间的多肽片段大概占到15%;600Da~1500Da之间的多肽分子片段大概占26%;300Da~600Da之间的多肽接近19%;300Da以下的多肽分子大约占总量的14%。根据所测的结果,经过不同分子质量的超滤膜以及纳滤膜设备(2000Da、1000Da、600Da、300Da)对小麦胚芽多肽进行超滤分段和纳滤除盐,最后得到5种不同分子质量的小麦胚芽多肽,分别是:MPT-1(大于2000Da的多肽)、MPT-2(1000~2000Da之间的多肽)、MPT-3(600~1000Da之间的多肽)、MPT-4(300~600Da之间的多肽)、MPT-5(小于300Da的多肽)。(2)抗氧化活性研究通过对不同分子量和不同浓度的小麦胚芽多肽的体外抗氧化活性实验研究,结果显示出不同浓度的小麦胚芽多肽对DPPH·、O2-以及OH·都有一定的清除作用,且随多肽浓度的增大,对DPPH·、O2-以及OH·清除率也随之增加。对于不同分子量的小麦胚芽多肽在同一浓度下进行DPPH·清除率和O2-清除率的测定时,随着分子量的降低,其活性越来越强,MPT-4分子段的清除率最好,分别可以达到92.3%和57.61%。对于相同浓度的麦胚多肽分子量小的的麦胚多肽的对OH·的清除率高,在相同浓度下,MPT-4的清除率最高,可以达到75.24%。建立小白鼠的氧化损伤模型,把170只小白鼠随机分成17组,即正常对照组、模型对照组、不同分子质量以及不同剂量的小麦胚芽多肽实验组。除正常对照组外,其余各组进行腹部注射600mg/(kg·d)D-半乳糖建立氧化损伤模型,5种不同分子质量的多肽组灌胃低、中、高剂量的小麦胚芽多肽,实验周期为30d,最后进行眼球取血,处死小鼠并解剖,测定血清、肝脏中的超氧化物歧化酶(SOD)的活性、谷胱甘肽过氧化物(GSH-Px)酶的活性、丙二醛(MDA)的含量以及总抗氧化能力(T-AOC),研究不同分子质量小麦胚芽多肽的体内抗氧化活性。结果表明:小麦胚芽多肽能够使小鼠血清和肝脏中SOD、GSH-Px以及T-AOC的指标升高,降低小鼠血清和肝脏中脂质过氧化物的MDA含量,具有良好的抗氧化活性。总体来说,随着多肽浓度的升高,抗氧化活性也随之增强,分子质量在1000Da以下的小麦胚芽多肽具有较强的抗氧化活性。(3)抗疲劳作用主要研究麦胚多肽的抗疲劳效果,包括动物耐力实验:对小鼠灌胃不同浓度的小麦胚芽多肽,进行游泳实验以及爬杆实验。耐缺氧实验:对小鼠灌胃不同浓度的小麦胚芽多肽,进行常压耐缺氧实验以及急性脑缺血型实验。体内抗疲劳作用:主要目的在于研究小麦胚芽多肽对对运动小鼠血液生化的影响,内容包括全血乳酸测定和肝糖原测定实验。结果表明:不同分子量的麦胚多肽在200-1000mg/(kg bw·d)剂量范围具有延长小鼠爬杆时间、游泳时间、抑制小鼠运动后全血乳酸含量的活性,并可维持运动后肝糖原含量等作用,并且在这个范围内,高剂量的作用效果明显好于低剂量的作用效果。对于不同分子量的麦胚多肽,MPT-3(600~1000Da)、MPT-4(300~600Da)、MPT-5(小于300Da)的作用效果比MPT-1(大于2000Da)、MPT-2(1000~2000Da)多肽组的效果要好。小麦胚芽多肽能够显著延长小鼠的常压抗缺氧时间,在200~1000mg/(kg bw·d)剂量范围内具有显著作用,分子量在1000Da以下的多肽的作用效果更加明显。(4)降胆固醇活性利用模拟胆汁胶束法研究小麦胚芽多肽的降胆固醇活性,制备体外模拟胆汁胶束溶液,模拟人体肠道环境,分析测定胆固醇在胆汁胶束溶液中的溶解度,验证小麦胚芽多肽的降胆固醇活性。结果表明:不同浓度的麦胚多肽对体系中的胆固醇都有一定的抑制作用,低分子肽组MPT-3、MPT-4和MPT-5组的胆固醇含量经过模拟胆汁胶束后与MPT-1相比差异性显著(P<0.05)。胆固醇的含量与多肽的分子量有一定的关系,随着分子量的变小,体系中胆固醇的含量降低。麦胚多肽对胆固醇具有明显的的抑制作用,抑制率一般在50%~60%左右,最高可以达到57.3%;而且分子量越低,对胆固醇的抑制作用越明显,MPT-4组的胆固醇抑制率最好。
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