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研究背景乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,近年来得益于肿瘤筛查和系统治疗方案的普及,乳腺癌患者的死亡率正在逐步下降,但仍有一部分患者面临复发及死亡风险。寻找新的肿瘤标记物是乳腺癌研究领域的重要方向,通过肿瘤标记物的表达情况可以更准确地预测患者预后,并为治疗提供参考价值。尽管近年来随着组学技术在乳腺癌诊疗中的应用,临床对乳腺癌患者的预后预测愈发精准,但在相对落后的国家和地区组学检测平台普及性较低,限制了这些技术的广泛应用,而使用简单且经典的方法（例如免疫组织化学染色法）来评估预后标记物的表达并用于预后预测则更加便捷与高效。我们以往的研究发现Y干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶（Gamma-interferon-inducible lysosomal thiol reductase,GILT,又名 IFI30）在乳腺癌与正常乳腺组织之间的表达具有显著差异,并且乳腺癌组织GILT高表达的患者3年无病生存（disease free survival,DFS）率更高。GILT是一个巯基还原酶,能够在酸性条件下打开蛋白质二硫键,并参与抗原递呈、自噬调节、氧化还原调节和细胞增殖等生物学过程。研究发现GILT在黑色素瘤、弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）和神经胶质瘤患者中的表达与患者预后相关,但其影响肿瘤患者预后的作用机制仍不明确。GILT早期研究主要集中在其对抗原加工递呈过程中的作用,部分肿瘤中的研究表明GILT可能会通过促进肿瘤细胞对自身的抗原递呈从而促进肿瘤免疫,近期研究发现GILT除了具有多种免疫调控功能外,还在多种病理生理过程中发挥关键作用。为了进一步验证GILT表达对于乳腺癌患者预后的预测价值,探索GILT对乳腺癌细胞生物学行为和治疗敏感性的影响及其作用机制,我们开展了本研究。研究方法1.经过研究单位伦理批准与患者知情同意后,选取来自山东大学第二医院乳腺外科2006年～2014年就诊的乳腺癌病人作为队列1,来自临沂市人民医院和临沂市肿瘤医院2004年～2009年就诊的乳腺癌病人作为队列2。根据入组和排除标准,队列1最终入组416人,队列2入组210人,使用免疫组织化学法对乳腺癌患者的石蜡切片进行GILT表达水平评估。主要研究结局为乳腺癌特异性生存（Breast Cancer-Specific Survival,BCSS）和 DFS。对 GILT 高和低表达患者的基线特征进行比较,应用斯皮尔曼相关分析对GILT表达总分（0～8分）与ER阳性细胞比例、PR阳性细胞比例、肿瘤大小、淋巴结转移状态、组织学分级、Ki67水平等临床因素进行双变量相关性分析。使用Kaplan-Meier法和COX多因素生存分析确定GILT对乳腺癌预后的影响。2.使用GILT过表达与沉默表达慢病毒转染乳腺癌细胞株,检测细胞增殖、侵袭、迁移、克隆形成、裸鼠皮下成瘤能力和细胞周期的改变,检测乳腺癌细胞对放疗、化疗和靶向治疗敏感性的改变。3.使用蛋白质组学分析GILT过表达后蛋白表达谱的改变,检测GILT对细胞活性氧（Reactive oxygen species,ROS）水平的影响,检测自噬相关通路蛋白的改变,使用ROS抑制剂与自噬抑制剂作用于细胞,观察GILT是否通过影响ROS与自噬活性影响乳腺癌细胞增殖。研究结果1.将GILT免疫组化强度（0～3分）与范围（0～5分）之和作为总分（0～8分）,根据患者是否发生DFS事件作为判断标准,确定最佳截断值（CUT-OFF）为4.5分,将病人分为GILT高表达（总分＞4分）和GILT低表达（总分≤4分）。相关性分析结果显示GILT表达总分与ER阳性细胞比例、PR阳性细胞比例正相关,与肿瘤大小、淋巴结转移状态、Ki67水平负相关。GILT高表达患者预后（DFS,BCSS）更好,GILT高表达与低表达相比,5年BCSS率更高（97.2%vs.86.0%,P＜0.001）,5 年DFS 率也更高（95.1%vs.76.6%,P＜0.001）。在COX多因素生存分析中,针对常见临床预后因素进行校正,结果发现GILT高表达是乳腺癌患者更好预后的独立预测指标,GILT高表达相对于低表达,BCSS事件风险降低 81.7%（HR=0.183,95%CI:0.078-0.431）,DFS 事件风险降低 79.8%（HR=0.202,95%CI:0.111-0.366）。利用队列2患者进行生存分析同样证实乳腺癌组织GILT高表达是患者有更好预后的独立预测指标,在多因素COX比例风险回归模型中,乳腺癌患者GILT高表达与获得更佳的DFS（HR=0.453,95%CI:0.235-0.873）和 BCSS（HR=0.488,95%CI:0.245-0.970）显著相关。2.体外细胞和体内动物实验证实GILT高表达可以抑制乳腺癌细胞增殖、克隆形成、细胞周期、迁移、侵袭和裸鼠皮下成瘤能力;GILT可以增加三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231与Luminal A型细胞MCF-7对多西他赛和表柔比星的敏感性;可以提高HER2阳性乳腺癌细胞BT-474对曲妥珠单抗靶向治疗的敏感性;可以提高MDA-MB-231细胞与BT-474细胞对放疗的敏感性。3.对过表达GILT及对照组的BT-474细胞进行蛋白质组学分析发现,过表达GILT的BT-474细胞中自噬调控蛋白MAP2K2、ATG7、ATG5、NRBF2和LAMP2表达下调。KEGG通路富集分析显示,GILT过表达后自噬调控通路显著下调。Western Blot和免疫荧光检测发现GILT过表达后LC3B表达降低,同时GILT过表达能够抑制饥饿、雷帕霉素和巴弗洛霉素等诱导的LC3-Ⅱ水平的升高。GILT过表达还能抑制细胞ROS水平。沉默GILT表达后细胞增殖能力增强,使用自噬抑制剂和ROS清除剂后,增殖能力恢复到正常水平,表明GILT可通过抑制自噬与ROS抑制乳腺癌细胞的增殖。研究结论通过本研究,我们使用内部及外部数据证实乳腺癌组织GILT高表达是患者有更佳预后的独立预测指标;GILT与ER阳性细胞比例、PR阳性细胞比例正相关,与肿瘤大小、淋巴结转移状态、Ki67水平负相关;GILT可以抑制乳腺癌细胞的增殖、细胞周期、克隆形成、裸鼠成瘤、侵袭迁移能力,并与临床分析结果中GILT与Ki67、肿瘤大小和淋巴结转移相关性结论一致;GILT可以增强癌细胞对多种治疗的敏感性;对作用机制的研究发现GILT可以通过抑制自噬与ROS水平来抑制乳腺癌细胞增殖。