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研究背景食管癌（EC）作为消化系统常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率位居所有恶性肿瘤的第7位、第6位。根据组织学分类,EC主要包括食管鳞状细胞癌（ESCC）和食管腺癌（EA）。ESCC作为我国最常见的EC病理类型,占所有EC的85%以上。近年来,尽管诊疗技术得到显著提升,ESCC患者预后仍然较差,五年总体生存率仅为20-40%。淋巴结转移（LNM）作为ESCC患者独立的预后危险因素,是其预后不佳的主要原因。所以术前判断淋巴结的转移状态,进而做出准确的TNM分期对于ESCC患者的治疗至关重要。尽管增强CT、超声内镜（EUS）等可用于术前评估淋巴结的转移状态,但是均有一定的局限性。癌胚抗原（CEA）等肿瘤标志物虽然对ESCC的发生起到一定的警示作用,但均无法用于预警ESCC患者淋巴结的转移。因此,迫切地需要一种较为敏感的分子标志物,为预测ESCC患者淋巴结转移提供线索和依据,进而指导治疗方案的选择。近年来,外泌体（exosomes）在疾病的发生发展及诊疗中的作用备受关注。外泌体是由细胞在病理、生理条件下释放到细胞外的直径在30-200nm的双层囊泡结构,可携带一系列生物活性物质,如脂质、蛋白质和核酸（microRNA等）。在不同的病理生理状态下,外泌体的成分具有较大的差异,能够反应其分泌细胞的状态,因而在肿瘤的无创检查方面具有巨大的潜力。MicroRNAs（miRNAs）是一类长约17-24个碱基的非编码RNA,通过与其靶基因mRNA的3’非翻译区（3’-UTR）结合,导致mRNA的降解或抑制其翻译。相对于游离miRNAs而言,血浆外泌体中miRNAs因为有双层脂膜的保护,可避免被RNA酶降解,所以具有更高的稳定性。近年来,越来越多的外泌体miRNAs分子被证实可用于肿瘤的无创性诊断。但是血浆外泌体miRNAs能否用于术前判断ESCC患者淋巴结的转移状态尚不明确。此外,外泌体miRNAs在肿瘤的转移过程中发挥着重要的调控作用。肿瘤细胞分泌的外泌体miRNAs可被其他肿瘤细胞摄取,从而调控靶细胞的增殖凋亡、迁移侵袭能力及上皮-间质转化（EMT）。外泌体miRNAs还可以被肿瘤细胞周围的免疫细胞、血管内皮细胞、淋巴内皮细胞（HLECs）摄取,通过调控免疫应答、血管及淋巴管生成,为肿瘤的发生发展营造最佳的微环境。但是,截至目前外泌体miRNAs调控ESCC淋巴结转移,特别是ESCC相关淋巴管生成的机制尚不明确,需要进一步探索。目的1.探索与ESCC患者LNM密切相关的血浆外泌体miRNAs,并评估其在预警ESCC患者LNM的诊断效能;2.探索外泌体miR-10527-5p对ESCC淋巴结转移及淋巴管生成的调控作用及具体分子机制。方法1.外泌体miRNAs在ESCC患者血浆中表达及临床应用的分析1.1通过small RNA测序、GEO数据分析及qRT-PCR技术,对血浆外泌体中与ESCC患者LNM密切相关的miRNAs进行筛选和验证,并通过受试者工作曲线（ROC曲线）评估其在预警ESCC患者LNM中的诊断效能。1.2外泌体miR-10527-5p与LNM关系的分析:通过χ2检验分析血浆外泌体miR-10527-5p与ESCC患者临床特征间的关系。2.外泌体miR-10527-5p调控ESCC淋巴转移及淋巴管生成的作用及机制的分析2.1外泌体miR-10527-5p对ESCC、HLECs细胞的作用及信号通路的分析:构建miR-10527-5p过表达、敲低ESCC细胞系,通过细胞划痕、Transwell及Western blot实验检测miR-10527-5p对ESCC细胞迁移侵袭、EMT进程及Wnt/β-catenin通路的影响。提取对照组、miR-10527-5p过表达组Eca109细胞外泌体,并通过透射电镜、ZetaView粒径分析、Western blot进行鉴定。将各组外泌体分别与KYSE150、HLECs细胞共培养,通过PKH67外泌体标记、qRT-PCR实验检测KYSE150、HLECs细胞对外泌体的摄取情况;通过细胞功能实验、Western blot检测外泌体miR-10527-5p对KYSE150、HLECs细胞功能及通路的影响。通过腘窝淋巴结转移模型检测外泌体miR-10527-5p对淋巴管生成及淋巴结转移的影响。2.2 miR-10527-5p靶基因预测及功能验证的分析:对miR-10527-5p的下游靶基因进行预测及验证;运用荧光原位杂交技术检测miR-10527-5p及其靶基因Rab10共定位情况;放线菌素D处理各组细胞后,通过qRT-PCR检测miR-10527-5p对Rab10 mRNA稳定性的影响;运用双荧光素酶报告实验检测miR-10527-5p对Rab10 mRNA 3’-UTR的靶向调控作用。通过“挽救实验”明确Rab10在外泌体miR-10527-5p调控KYSE150、HLECs细胞中发挥的作用。通过IHC检测足垫肿瘤、ESCC组织中Rab10的表达,并分析Rab10表达与ESCC患者预后的关系。结果1.血浆外泌体miR-10527-5p、miR-493-5p可用于术前判断ESCC患者LNM状态1.1外泌体miR-10527-5p、miR-493-5p在伴有LNM（LNM+）组患者血浆中的表达较无LNM（LNM-）组显著降低。ROC曲线分析显示,二者在术前预警ESCC淋巴结转移方面均有着较高的敏感性、特异性。1.2血浆外泌体miR-10527-5p低表达的患者肿瘤往往更大、T分期往往更晚、且往往伴有淋巴结转移。2.外泌体miR-10527-5p可通过靶向Rab10阻断Wnt/β-catenin通路,进而抑制ESCC迁移侵袭及淋巴管生成2.1 miR-10527-5p过表达可显著抑制ESCC细胞的迁移侵袭、EMT进程及Wnt/β-catenin 通路。外泌体可将 miR-10527-5p 包裹,荷载 miR-10527-5p 的 Eca109 细胞外泌体可被KYSE150细胞摄取。与对照组相比,外泌体miR-10527-5p处理组KYSE150细胞迁移侵袭能力、EMT进程及Wnt/β-catenin通路明显受到抑制。此外,外泌体miR-10527-5p还可被HLECs细胞摄取,进而抑制HLECs细胞迁移及小管生成。2.2 Rab10作为miR-10527-5p的下游直接靶基因,在LNM+的ESCC组织中高表达,且Rab10表达与ESCC患者的预后相关,Rab10高表达的患者较Rab10低表达者预后差。过表达Rab10可显著逆转外泌体miR-10527-5p对ESCC、HLECs细胞的抑制作用。结论1.外泌体miR-10527-5p、miR-493-5p在LNM+组ESCC患者术前血浆中表达降低,二者可用于术前判断ESCC患者的淋巴结转移状态。2.血浆外泌体miR-10527-5p与ESCC患者肿瘤大小、T分期、LNM状态呈明显负相关。3.荷载miR-10527-5p的外泌体可通过阻断Wnt/β-catenin信号通路,一方面抑制ESCC细胞的迁移、侵袭,另一方面降低HLECs细胞的迁移、成管能力,进而体内抑制ESCC相关淋巴管生成及淋巴结转移。4.Rab10是外泌体miR-10527-5p调控ESCC转移的关键靶基因,过表达Rab10可显著逆转外泌体miR-10527-5p对KYSE150、HLECs细胞的抑制作用。