畜禽过度使用抗生素容易产生耐药性,引发食品安全问题,寻找绿色、安全、高效、无污染、无残留的抗生素替代品成为研究热点。益生菌和中兽药是畜牧业无抗时代最有前途的抗生素替代品,但存在见效慢、效果不稳定、有刺激性气味、适口性差等缺点,解决此问题的方法之一是将中药进行益生菌发酵。黄芪是一种传统补益类中药,具有抗炎、抗病毒、抗氧化和提高免疫力等作用,主要药性活性物质为黄芪多糖等。由于植物细胞壁的阻碍作用,药性活性物质的提取效率和利用效率低。利用益生菌发酵进行生物转化是提高黄芪利用效率的有效途径之一。虽然黄芪的液体发酵已有报道,但更为高效的固体发酵工艺很少涉及,发酵后小分子代谢物质缺少系统了解;同时,也缺少发酵黄芪对蛋鸡进行全面深入的评价。本研究利用植物乳杆菌固体发酵黄芪,分析发酵黄芪的代谢组学和微生物菌群的演变规律;进一步将其在蛋鸡上应用,观察其对蛋鸡肠道菌群、生产性能、抗氧化功能和免疫因子的影响,旨在全面系统了解植物乳杆菌发酵黄芪代谢产物,阐明其对动物饲用效果的分子机制,同时为发酵黄芪替代抗生素的应用提供理论依据、生产工艺和质量标准参数。主要研究内容如下:1.植物乳杆菌固体发酵黄芪代谢产物的常规分析及菌群变化监测利用植物乳杆菌、屎肠球菌、植物乳杆菌+屎肠球菌分别对黄芪进行固体发酵,以不加益生菌为空白对照。37℃固体发酵30天,分别在第0、3和30天采取发酵样品,利用苯酚-硫酸法等测定发酵黄芪药性活性成分黄芪多糖,利用液相色谱技术分析发酵后有机酸代谢产物变化,利用单分子实时测序技术(SMRT)绘制发酵黄芪微生物菌群谱。结果表明植物乳杆菌发酵黄芪多糖产率为9.43%;乙酸、丙酸、丁酸、乳酸含量分别为1723.01 mg/kg、173.29 mg/kg、616.07 mg/kg和1946.17 mg/kg;发酵第3天各发酵组微生物种水平菌群谱分析表明:植物乳杆菌组植物乳杆菌占比23.55%,屎肠球菌组屎肠球菌占比31.2%,混菌发酵组植物乳杆菌占比29.4%,屎肠球菌占比8.32%,表明发酵菌群谱与接入菌种呈正相关。发酵第30天,植物乳杆菌组α-多样性指数最高,表明其微生物丰度和多样性更丰富。SMRT分析技术可作为判定发酵黄芪微生物菌群谱质量标准的方法之一。2.植物乳杆菌固体发酵黄芪的代谢组学分析利用色谱-质谱联用技术对植物乳杆菌固体发酵黄芪和未发酵黄芪进行代谢组学分析。经KEGG数据库比较分析差异代谢物,正离子模式上调表达代谢物有1416种,下调表达代谢物有935种;负离子模式上调表达代谢物有1040种,下调表达代谢物有809种。代谢组学分析表明黄芪发酵前后差异代谢产物明显:发酵后酸类、脂类、酮类等氨基酸显著增加,烯类等氨基酸显著下调,共鉴定到上调代谢物15个,下调代谢物2个;关键代谢产物主要为α-硫酸二乙酯、2-甲基柠檬酸、3-异丙烯基-6-氧代庚酸等,涉及到丙酮酸代谢、丙酸代谢、半乳糖代谢等途径。结果表明,固体发酵通过这些代谢途径促进黄芪小分子物质的产生,有利于发现新的药性活性成分,为发酵黄芪在动物上的应用提供参考。3.植物乳杆菌发酵黄芪的蛋鸡饲用效果研究选择351日龄海兰褐蛋鸡240只,随机分4组:发酵黄芪组、未发酵黄芪组、植物乳杆菌组和空白对照组,每组设5个重复,每个重复12只,分别于试验后第14天和28天测定产蛋率、料蛋比和鸡蛋品质;利用ELISA检测血清过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)含量;利用实时荧光定量PCR检测干扰素-g(IFN-g)、白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)和诱导型一氧化氮合成酶(INOS)m RNA的表达量,以评价蛋鸡的抗氧化能力和免疫状况。结果显示,试验第14天,虽然各试验组生产性能、鸡蛋品质和抗氧化指标与对照组差异不显著(p>0.05),但发酵黄芪组回肠和盲肠中IFN-γm RNA表达量分别增加1.7倍(p<0.01)和2.1倍(p<0.01);回肠中TNF-am RNA和INOS m RNA的表达量分别增加3.1倍(p<0.001)和1.2倍(p<0.05);肝脏、回肠中IL-2 m RNA表达量分别增加1.1倍(p<0.05)和2.2倍(p<0.0001)。试验第28天,发酵黄芪组产蛋率比对照组提高了7.14%(p<0.05),料蛋比降低了6.6%(p<0.05);与对照组和未发酵黄芪组相比,发酵黄芪组过氧化氢酶含量分别提高了61.5%(p<0.05)和63.4%(p<0.05),谷胱甘肽过氧化物酶含量分别提高了62.4%(p<0.05)和54.9%(p<0.05),超氧化物歧化酶含量分别提高了68.0%(p<0.05)和55.4%(p<0.05);发酵黄芪组总抗氧化能力比对照组提高了52.6%(p<0.05)。与对照组相比,发酵黄芪组肝脏、脾脏、回肠和盲肠中IFN-γm RNA的表达量分别增加1.3倍(p<0.01)、1.4倍(p<0.01)、2.3倍(p<0.0001)和6.1倍(p<0.0001);TNF-am RNA的表达量分别增加了1.4倍(p<0.05)、1.4倍(p<0.01)、1.9倍(p<0.0001)和1.3倍(p<0.01);回肠、盲肠中INOS m RNA表达量分别增加2.0倍(p<0.0001)和3.5倍(p<0.0001);肝脏、脾脏、回肠、盲肠中IL-2 m RNA表达量分别增加了1.2倍(p<0.05)、1.5倍(p<0.001)、3.6倍(p<0.0001)和1.6倍(p<0.001)。以上结果表明使用发酵黄芪提高了蛋鸡抗氧化能力和免疫因子的表达量,提升了其生产性能。4.植物乳杆菌发酵黄芪对蛋鸡肠道菌群的影响随机采集4组第14天和28天回肠、盲肠样品,每个阶段每个肠道样品采集3份,共计48份,利用16S r RNA基因高通量测序分析蛋鸡回肠和盲肠肠道菌群变化。结果表明:使用28天后,发酵黄芪组盲肠Simpson(0.91±0.04)和Shannon(5.79±0.75)指数最高,表明其菌群更具多样性。从“门”水平分析发现:发酵黄芪组回肠中厚壁菌门和拟杆菌门丰度升高,变形菌门比例下降,表明使用发酵黄芪可降低回肠中有害菌丰度,而盲肠无明显变化。从“属”水平分析发现,Lactobacillus属主要在回肠,Bacteroides属主要在盲肠。使用28天后,发酵黄芪组回肠中Lactobacillus属丰度下降,其他3组大幅度提升;4组盲肠中Bacteroides属丰度均有所提升,使用黄芪、植物乳杆菌和发酵黄芪对回肠菌群丰度影响较大,但对盲肠菌群丰度影响较小。以上结果表明发酵黄芪影响蛋鸡回肠菌群丰度,有利于小肠消化吸收,从而提高蛋鸡生产性能。综上,本研究结合预防兽医学、发酵工程及中药学等技术进行多学科交叉研究,建立了固体发酵黄芪模型,测定了发酵黄芪多糖及有机酸含量,首次绘制了发酵黄芪微生物菌群谱,证实了发酵过程中优势菌群与初始接入菌呈正相关;系统、全面分析了黄芪发酵前后差异代谢产物和代谢途径,鉴定出上调代谢物15个,下调代谢物2个,揭示固体发酵菌种和发酵模式影响黄芪小分子物质产率;经发酵黄芪动物应用评价研究,阐明了发酵黄芪通过调节回肠菌群丰度、内脏器官和肠道中免疫因子m RNA的表达提升生产性能和免疫性能。本研究对固体发酵黄芪的理论和应用研究,为发酵黄芪替代抗生素在动物上应用提供了理论依据,对于促进发酵中药这一交叉学科的发展具有推动作用。