研究背景及目的　　人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)是一种调剂体内液体分布的最重要的调节剂，维持着血浆内80％的胶体渗透压(colloid osmotic pressure，COP)，也是在血液中运输许多内源性化合物（例如脂肪酸、血红素、胆红素等）的重要载体。HSA在临床上有着非常重要和广泛的用途，其适应证包含烧伤、白蛋白减少症、出血性休克、血容量不足、腹水、急性呼吸窘迫综合征等。但是，目前HSA在临床上的应用存在着诸多争议，这主要是由于机体在烧伤、失血等病理条件下血管内皮细胞常常会受到损伤，从而造成毛细血管的间隙增加，血管通透性增大。此时，应用HSA进行血容量扩充，输注到血管内的HSA会渗透到组织间隙中，造成组织水肿，进一步加重疾病的病情。另外，由于HSA的临床应用剂量较大，目前虽然应用基因工程技术已经能够成功表达生产出重组HSA，但实现高纯度、大规模的生产仍然面临着很大的挑战。因此，以血液为主要来源的HSA的供应仍旧十分紧张。　　针对HSA在临床应用中由于血管通透性增加所导致的渗出增加以及HSA来源较为紧张的问题，本实验室采用高相对分子质量（relative molecular mass,Mr）的PEG对HSA进行定点修饰，设想通过PEG修饰增大HSA的分子半径来减少HSA在血管内的渗漏、延长其半衰期、提高其用药安全性、降低其用药频率。本实验室在以往的研究中通过动态光散射和圆二色谱法证实了高MrPEG定点修饰可显著增加HSA的流体力学半径且不影响HSA的二级结构;通过125I放射标记法对HSA及其PEG修饰产物的药代动力学研究，证实了PEG-HSA的在体内的半衰期显著延长;通过小鼠急性肺损伤模型和大鼠脓毒血症模型证实了PEG修饰可有效减少HSA从血管的渗漏，能更有效地发挥血容量扩充的作用。　　本论文在本实验室以往的研究基础上，通过研究20 kDa直链和支链PEG定点修饰的HSA在大鼠失血性休克模型中作为血容量扩充剂的疗效，考察PEG修饰对HSA作为血容量扩充剂的影响和其相关机制，并考察支链PEG修饰的HSA是否具有药效学的优势;利用小角散射技术研究不同Mr和不同构型的PEG在HSA表面的空间取向和对蛋白结构的影响，并采用表面等离子共振技术(surfaceplasmon resonance，SPR)研究其对于临近Cys34的血红素结合位点结合能力的影响;通过采用Nano液相-串联质谱（nanoliquid chromatography tandem masschromatography，NanoLC-MS/MS）检测PEG-HSA经酶解后的肽段来对完整的PEG-HSA进行定量，建立了一种新的高灵敏度、高选择性地对大鼠血浆中的PEG-HSA进行定量的方法，以解决放射性同位素不稳定、易脱落的问题，为更准确地反映药物真实的药代动力学情况提供新的方法。　　本论文的主要研究内容、研究方法和研究结果　　1PEG定点修饰的HSA用于失血性休克血液复苏的研究　　方法:本论文采用大鼠的失血性休克模型，以生理盐水、8％HSA和25％HSA作为对照，考察了直链和支链的20 kDaPEG定点修饰的HSA作为血容量扩充剂的血液复苏疗效和对再灌注损伤的影响。利用大鼠的平均动脉压和血气参数来反映大鼠在失血性休克和血液复苏治疗中的整体状态;利用血液流变学参数来评价不同的血容量扩充剂对大鼠血液中红细胞性质和血液黏度的影响。血液及组织中内皮型NO合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)和单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)的含量分别与血管壁的剪切应力和血管的收缩扩张有关，因此本论文利用MCP-1和eNOS来评价血液复苏后微血管的状态。另外，本论文通过对炎症相关因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)和凋亡相关蛋白bax、bcl-2进行了检测，同时结合对大鼠肺部组织进行的苏木素/伊红(haematoxylin and eosin，HE)染色，全面研究实验中大鼠肺部组织的再灌注损伤情况，综合评价PEG修饰的HSA用于失血性休克血液复苏的防护作用及机制。　　结果:在血液复苏90 min时，直链和支链20 kDaPEG定点修饰的HSA（L-PEG-HSA和Y-PEG-HSA）组大鼠的平均动脉压分别为（91.00±2.10）mmHg、（91.83±1.17）mmHg，要显著高于生理盐水组（（67.29±4.46）mmHg）、8％HSA(HSA8)组（（73.17±5.95)mmHg）、25％HSA(HSA25)组（（83.00±2.53)mmHg）。两组PEG-HSAs实验组的PaO2、pH、Hb、BE等血气指标与休克结束时相比也有显著性地改善。这表明，与HSA相比，PEG-HSAs能在相对更长的时间内发挥更有效的血容量扩充作用，能更有效地提高大鼠的平均动脉压、血气参数。另外，PEG-HSAs能促进大鼠体内的MCP-1和eNOS的表达，显著提高全血低切还原黏度和血浆黏度。Western blot实验和HE病理染色的结果则表明，HSA25、L-PEG-HSA和Y-PEG-HSA三种高渗透性的血容量扩充剂能够显著抑制肺组织炎症相关因子（TNF-α，NF-κB）和凋亡相关蛋白(bax，bcl-2)的表达，减轻肺部组织的再灌注损伤。　　本论文未发现支链PEG修饰的HSA具有疗效上的优势。而值得注意的是，血液复苏结束后，PEG-HSAs组大鼠血液的血沉方程K值有所增加(L-PEG-HSA，4.38±1.01; Y-PEG-HSA，5.06±0.36)，与生理盐水组（3.51±0.55）、HSA8（3.24±0.46）和HSA25（3.20±0.81）实验组相比有显著性差异，其中Y-PEG-HSA实验组表现得尤为明显。另外，与生理盐水组（0.92±0.08）相比，HSA（HSA8，1.04±0.08;HSA25，1.11±0.28）能够增加血液红细胞的变形性指数，但是PEG修饰会减弱HSA的这一功能，特别是Y形PEG修饰(L-PEG-HSA，1.05±0.04; Y-PEG-HSA，0.95±0.06)。　　2PEG定点修饰的HSA在溶液中的结构以及药物结合性质的研究　　方法:本论文采用小角中子散射的方法研究了直链5kDa、10 kDa、20 kDa和40 kDa PEG和支链20 kDa、40 kDa PEG定点修饰HSA的Cys34后所得PEG-HSAs聚合物在溶液中的构象;还采用表面等离子共振技术(surface plasmonresonance，SPR)研究不同Mr和不同构型的PEG修饰对于临近HSA Cys34的血红素结合位点结合能力的影响。　　结果:HSA、PEG5kD-HSA、PEG10kD-HSA、PEG20kD-HSA、Y-PEG20kD-HSA、PEG40kD-HSA、Y-PEG40kD-HSA的旋转半径分别为2.27±0.01、2.42±0.04、2.44±0.01、2.52±0.01、2.61±0.02、2.50±0.02、2.60±0.04 nm;分子最大直径分别为6.22±0.04、6.79±0.1、6.97±0.07、7.07±0.04、7.36±0.11、7.00±0.00、7.49±0.23 nm。这表明，经PEG修饰后，HSA在溶液中的构象有所延伸扩展，分子直径增加。支链PEG修饰的HSA相对于同等Mr的直链PEG修饰的HSA拥有相对更大的旋转半径(the radii of gyration，Rg)和最大直径(the maximumdimension ofthe scattering particle，Dmax)。Y-PEG40kD-HSA的散射曲线在小q处的干扰峰最为明显。结合电泳图中Y-PEG40kD-HSA比相同Mr的直链PEG修饰的PEG40kD-HSA的表观Mr明显大很多，表明支链PEG的空间结构有较大的空间位阻，也能赋予HSA更强的分子间相互排斥作用。HSA和PEG-HSAs的P(R)函数的最大峰值M对应的r均在3 nm左右，表明直链和支链不同Mr的PEG修饰对蛋白质自身的结构几乎没有影响。利用DAMMIN对小角散射的数据进行重头建模得到的HSA和PEG-HSA在溶液中的三维构象表明，偶联在HSA表面的PEG自己形成一个无规则线团覆盖在HSA表面上，与HSA更倾向于彼此之间相互影响作用形成一个类似球体的PEG-HSA的复合物。与相同Mr的线性PEG相比，支链PEG的两条链虽然连接在同一个末端，但是彼此分别在HSA表面形成两个独立的相互排斥的无规则线团。　　HSA、 PEG5kD-HSA、 PEG10kD-HSA、 PEG20kD-HSA、Y-PEG20kD-HSA、PEG40kD-HSA、Y-PEG40kD-HSA与血红素作用的为平衡解离常数(equilibriumdissociation constant, KD)分别为(5.10±0.70)×10-9、(46.83±3.70)×10-9、(7.75±2.03)×10-9、(9.04±0.42)×10-9、(7.18±1.88)×10-9、(84.43±0.74)×10-9、(26.53±2.87)×10-9mol/L，这表明直链PEG5kD、直链PEG40kD和支链PEG40kD修饰大大降低了HSA和血红素结合的亲和力，而直链PEG10kD、直链PEG20kD和支链PEG20kD对HSA和血红素的结合基本没有影响。　　3大鼠血浆中PEG-HSA基于NanoLC-MS/MS的定量分析方法的建立　　本论文通过采用Nano液相-串联质谱(nanoliquid chromatography tandemmass chromatography，NanoLC-MS/MS)检测PEG-HSA经酶解后的肽段来对完整的PEG-HSA进行定量，建立了一种新的PEG-HSA在大鼠血浆中含量的测定方法，该方法选择性好、灵敏度高。采用液液萃取法，利用与水混溶的酸性有机溶剂从血浆中提取待测物PEG-HSA与内标PEG-BSA，色谱分析采用自制的纳流C18柱（直径75μm，长度150 mm）。采用PEG-HSA经酶解后的HPYFYAPELLFFAK肽段和PEG-BSA酶解后的HPYFYAPELLYYANK肽段进行定量，用于这两个肽段定量分析的离子反应分别为m/z581.6→779.4和m/z936.0→1491.9。采用甲酸(formic acid，FA)和乙腈(acetonitrile，ACN)作为流动相试剂，流动相A相为0.1％FA/H20、B相为0.1％FA/ACN，流速为300 nl/min，进样梯度为5 min8％B、45 min35％B、50 min90％B、60 min90％B。在50～3000ng/mL的浓度范围内线性表现良好，定量下限为50ng/mL，批内、批间精密度（以相对标准偏差表示）均小于15％，准确度（以相对误差表示）在15％以内。　　本论文的创新性以及取得的主要成果和结论:　　1.首次考察了20 kDa直链和支链PEG定点修饰的HSA在大鼠失血性休克模型中作为血容量扩充剂的疗效，证实了高MrPEG定点修饰的HSA作为血容量扩充剂的优势，揭示了PEG的高黏性和高渗性分别有助于增加微血管的灌注和减轻肺部缺血再灌注损伤，发现了支链PEG修饰对红细胞的聚集性和变形性的影响，为PEG修饰剂构型的选择提供一定的理论基础，同时也为PEG-HSA临床应用提供重要的参考依据。　　2.首次采用小角中子散射技术研究了不同Mr和不同构型的PEG修饰剂在HSA表面的空间取向和对蛋白结构的影响，并首次采用SPR技术研究其对于临近Cys34的血红素结合位点结合能力的影响，更好地从理论上解释了PEG修饰赋予蛋白质药物在体内的优势，例如分子半径增加、半衰期延长、免疫原性降低等，同时也为PEG修饰剂Mr、结构和修饰位点的选择优化提供了新的研究方法。　　3.首次采用NanoLC-MS/MS通过检测PEG-HSA经酶解后的肽段来测定完整的PEG-HSA在大鼠血浆中的浓度，建立了一种新的具有高灵敏度和高选择性的定量方法，可以解决放射性同位素标记不稳定、易脱落以及难以反映药物真实药代动力学情况的问题。此方法的专属性良好，方法的准确度、精密度、提取回收率、基质效应、稳定性等都符合相关要求，适用于药代动力学大批样本的测定。