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果胶是非淀粉多糖的成分之一。由于动物体内缺乏降解果胶的酶类,因而果胶被认为是动物饲料中的抗营养因子。如果能生产出降解果胶的有效酶,将大大提高饲料利用率,有效降低饲料成本。因此,开发鹅源草酸青霉产果胶酶工艺研究,是当今动物营养领域重要的研究课题。
本试验以研究室从五龙鹅肠道分离的草酸青霉(Penicillium oxalicum Currie&Thom)为发酵菌种,通过对聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶裂解酶(PL)、果胶酯酶(PE)活力的测定,研究了培养基组成及不同发酵条件对草酸青霉产果胶酶活力的影响,并通过L9(34)正交试验确定草酸青霉发酵生产果胶酶不同组分的最佳发酵条件。发酵液经硫酸铵分级盐析、SephacrylS-200分子筛柱层析、DEAE-Sephadex离子交换层析技术,从果胶酶中分离纯出两种主要组分并进行了酶学性质研究。此外,试验确定了制备粗酶制剂的工艺条件,制备出果胶酶制剂,探索出果胶酶生产新工艺。
另外,为了探索果胶酶制剂对鹅消化吸收的影响,选取24月龄的健康五龙鹅24只,随机分为4组,每组6个重复。各试验组日粮果胶酶的添加水平分别为0%、0.1%、0.2%、0.3%,采用全收粪法进行代谢试验,检测饲料与粪便中的各种营养成分,确定其消化率,并观察肠道微生物菌群变化。
主要获得如下研究结果:
1.果胶酶不同组分最佳发酵条件研究结果表明:以葡萄糖为碳源,可以诱导PG、PL、PE产生。每15g基础培养基中,葡萄糖的最适添加量分别为1.2g,1.5g,1.5g;(NH4)2SO4对PG、PE、PL产生有明显刺激作用,其适宜添加量分别为0.6g,1.5g,0.3g;KH2PO4对PG活力有明显的提高作用,MgSO4和KH2PO4对PL有极显著影响(P<0.01)。15g培养基装量,PG、PE、PL最佳接种量分别为1.5ml、2ml、1.5ml,最佳培养温度分别为32℃、30℃、32℃,培养基最佳初始pH分别为5.0、4.0、4.5。最佳发酵时间分别为60h、72h、84h。
2.果胶酶主要组分纯化结果表明:PG和PE纯化倍数分别为32.21和23.98,均达到电泳纯,分子量分别为61.4KDa和42.2KDa。PG最适作用pH为5.0,最适反应温度为40℃;pH稳定范围为4~6,在30℃与40℃随着处理时间的延长酶活力保持稳定。PE最适作用pH为6,最适温度为50℃。pH稳定范围为5~7,PE在30℃时的热稳定性较好,40℃时处理60min,酶活力变化不明显。说明PG和PE纯化工艺比较成功。
3.果胶酶制剂制备条件研究结果表明:每15g基础培养基中葡萄糖0.9g、(NH4)2SO4最适添加量为1.2g, KH2PO4(K2HPO4、MgSO4、CaCl2)0.07g。发酵参数为:培养基起始pH为4.5,发酵时间为60h,发酵温度为30℃,接种量为1.5ml。最适合的果胶酶的浸提剂为1% NaCl。酶液最适浓缩倍数为5倍,以麸皮为载体,冷冻干燥后固态果胶酶制剂酶活得率最高,为89.89%(P<0.01);并且固态酶制剂的耐贮性比液态酶制剂好。随着贮存时间延长,PG、PE、PL三种组分酶活力下降,但是不同组分与总酶活力比值基本不变,分别约为50%、69%和0.005%。
4.果胶酶对动物日粮消化代谢试验结果表明:在代谢能(ME)和粗蛋白(CP)摄入量基本一致的条件下,随着果胶酶添加水平的提高,粗纤维(CF)的消化率为20.55%~37.59%,中性洗涤纤维(NDF)38.74%~55.62%,酸性洗涤纤维(ADF)34.03%~47.98%;第3组粪中的氨态氮(NH3-N)浓度最低,为1.20 mg/kg,与其他组相比差异显著或极显著(P<0.01或P<0.05);甘氨酸表观消化率偏低,但是,组间差异不显著,其它各种氨基酸表观消化率(AAAD)均较高(72.19%~94.27%)。Ca、P的表观消化率随果胶酶添加水平的递增均呈先上升后下降趋势。果胶酶添加量在0%~0.3%之间时,粪便中乳酸杆菌、双歧杆菌、酵母菌均呈先上升后下降趋势,大肠杆菌数量总体呈下降趋势。说明日粮中添加适量的果胶酶制剂能够有效地提高鹅对营养物质的消化吸收率。