10H-3,6-二氮杂吩噻嗪对肝癌细胞增殖、凋亡、侵袭功能的影响及其机制研究

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目的:探索10H-3,6-二氮杂吩噻嗪对肝癌细胞HepG2生物学行为的影响及其作用机制,为肝癌的综合治疗提供新的思路。方法:本研究设计将样品分为三组,即未接受治疗的未治疗组,接受标准对照顺铂IC5Q浓度的阳性对照,以及接受测试化合物10H-3,6-二氮杂吩噻嗪(PTZ)的IC50浓度的治疗组,PTZ化合物的合成参照出版物获得的信息合成,肝癌细胞株选择HepG2。通过MTT实验进行增殖功能测定,通过吖啶橙/碘化丙啶双重染色(AO/PI)双染色评估细胞凋亡的形态,通过膜联蛋白V-FITC染色定量细胞凋亡,Transwell实验验证细胞侵袭能力。通过测定细胞内活性氧、线粒体细胞色素c、半胱天冬酶活性及线粒体硫氧还蛋白还原酶的活性去阐释PTZ的抗肝癌作用机制。结果:本研究设计将样品分为三组,即未接受治疗的未治疗组,接受标准对照顺铂IC50浓度的阳性对照,以及接受测试化合物PTZ的IC50浓度的治疗组。将HepG2癌细胞接种在96孔平底板中,密度为1×105个细胞/孔。通过将化合物在DMSO(二甲基亚砜)中溶解至80mM的储备浓度,并进一步稀释成2.5,5,10,20,40,80μM,0μM用作未处理的对照,并进一步在CO2培养箱中温育24小时。MTT测试显示PTZ在各浓度范围内对HepG2肝癌细胞显示出生长抑制作用;处理24小时后PTZ对HepG2肝癌细胞50%最大反应(IC50)的抑制浓度为37.03μM,阳性对照(顺铂)给予IC50值为109.23μM。通过吖啶橙/碘化丙啶双重染色(AO/PI)进行定性观察,荧光显微镜下观察可见,PTZ作用后的HepG2癌细胞发生凋亡,癌细胞形成碎片核,凝聚核,释放DNA内容物,形成膜起泡。同时注意到PTZ还诱导肝癌细胞坏死,肝细胞染成整个细胞的红色(图2:红色箭头指向)。膜联蛋白V-FITC定量测定HepG2癌细胞凋亡,流式细胞学进行凋亡分析显示PTZ对HepG2细胞的抑制的效力比阳性对照顺铂的效力高3倍。进一步检测细胞周期检查点发现,未处理的肝癌细胞在G0/G1期(80.93%)的数量最多,而在顺铂IC50和PTZ IC50浓度下处理后的肝癌细胞,大部分处于S期激活状态和S期停滞状态(顺铂组为74.90%;PTZ组为81.91%)。同时,Transwell实验表明PTZ对HepG2癌细胞的侵袭的抑制率可达43.64%。再通过细胞内活性氧(ROS)测量结果发现,用IC50浓度的PTZ处理HepG2癌细胞后,ROS的活性升高至218.62%,阳性对照组/顺铂处理组,ROS活性增加至158.16%,(未处理组ROS活性标准化为100%)。同时,流式细胞仪检测线粒体细胞色素c也在顺铂及PTZ处理组中呈显著量。在研究PTZ诱导肝癌细胞凋亡机制的过程中,定量测定Caspase-3/7、8、9、10四种半胱天冬酶活性,结果显示PTZ作用后的HepG2与未处理的对照相比半胱天蛋白酶(caspase-3/7,caspase-8,caspase-9和caspase-10)活性增加,半胱氨酸蛋白酶活性增加)。上调的半胱天冬酶活性提示测试化合物PTZ通过内在和外在途径诱导HepG2癌细胞的凋亡。最后进行线粒体硫氧还蛋白还原酶测定,将未处理对照的值标准化至100%并假设正常的硫氧还蛋白氧化还原酶(TrxR)酶活性,结果显示顺铂处理组的TrxR酶活性被抑制至19.52%,而PTZ处理组TrxR酶活性被抑制21.43%。结论:肝癌患者的高死亡率由癌细胞对化疗药物的耐药性所致。在本研究中,10H-3,6-二氮杂吩噻嗪(PTZ)与顺铂相比,PTZ对HepG2癌细胞的抑制比顺铂高3倍,在对PTZ抑制肝癌细胞的机制研究中发现,PTZ可激活S期细胞周期检查点,抑制癌细胞DNA复制过程,从而抑制细胞分裂。同时进一步分析细胞凋亡发现PTZ的抑制效应在增殖-静电效应开始后存在,因此,基因组损伤的癌细胞最终从肿瘤细胞群中清除。除此之外,活性氧(ROS)的细胞浓度增加、线粒体硫氧还蛋白还原酶(TrxR)酶活性抑制表明,PTZ选择性攻击癌细胞线粒体,从而限制了细胞增殖并增加其对凋亡信号的敏感性。
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