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目的泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system,UPS）的异常改变与肿瘤发生密切相关。E3泛素连接酶（ubiquitin ligase）是真核生物体内UPS的关键组分,根据结构特点,可将E3泛素连接酶分为两大类:RING（really interesting new gene）锌指结构域类和HECT（homologous to E6AP C-terminus）结构域类。HECW1（HECT,C2 and WW domain-containing protein 1）是HECT类泛素连接酶Nedd4家族9个成员中了解最少的分子,又称为NEDL1（Nedd4-Like Ubiquitin Protein Ligase 1）。在表达野生型p53的癌细胞中,HECW1可以通过与p53结合诱导肿瘤细胞凋亡。但是HECW1在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达以及其与NSCLC进展是否相关少有报道。本课题通过免疫组织化学技术（immunohistochemistry,IHC）检测NSCLC中HECW1的表达,探讨其表达水平与NSCLC患者临床病理特征、总生存期（overall survival,OS）和无进展生存期（progression-free survival,PFS）的关系,并进一步通过细胞功能实验来探究HECW1对NSCLC细胞增殖、迁移及侵袭的影响和相关的分子机制。方法1.选取2011年1月～2015年12月安徽医科大学第一附属医院收治的160例NSCLC患者为研究对象,并收集NSCLC患者临床病理资料,采用免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）检测NSCLC组织中HECW1的表达水平。根据检测结果将NSCLC患者分为HECW1高表达组与低表达组,分析NSCLC患者HECW1表达与其临床病理的关系。患者术后均接受5年随访并统计患者总生存率,采用Kaplan-Meier法对NSCLC患者总生存期（overall survival,OS）和无进展生存期（progression-free survival,PFS）进行分析。2.收集2016年3月至2019年7月在安徽医科大学第一附属医院接受根治性肺癌切除术的34例肿瘤组织和对应的正常肺组织,行实时定量聚合酶链反应（quantitative real-rime polymerase chain reaction,q RT-PCR）和蛋白质免疫印迹（western blot）检测HECW1 m RNA和蛋白的表达情况。3.体外培养NSCLC细胞株H1299,A549,H460,H226和正常人支气管上皮细胞BEAS-2B,以q RT-PCR和western blot检测HECW1 m RNA和蛋白的表达情况。4.构建和筛选HECW1过表达载体和干扰载体。在H1299细胞中转染HECW1过表达载体（HECW1）及对照（Vector）;在A549细胞中转染HECW1干扰载体（Si-HECW1）及对照（Si-NC）。QRT-PCR和western blot检测HECW1的表达,明确过表达和干扰效率;CCK-8检测对细胞增殖的影响;transwell检测对细胞迁移和侵袭的影响。5.在H1299细胞中转染HECW1过表达载体（HECW1）及对照（Vector）;在A549细胞中转染HECW1干扰载体（Si-HECW1）及对照（Si-NC）。QRT-PCR和western blot检测细胞中Smad4的表达水平。6.采用蛋白酶体抑制剂MG-132处理转染HECW1过表达载体的H1299细胞,western blot检测Smad4的表达水平。7.将Flag-HECW1与Myc-Smad4共转染H1299细胞,采用Myc抗体或Flag抗体检测HECW1与Smad4的结合情况;并采用泛素蛋白（HA标签）western blot检测Smad4的泛素化。8.在H1299细胞中共转染HECW1过表达载体与Smad4过表达载体。CCK-8检测对细胞增殖的影响;transwell检测对细胞迁移和侵袭的影响。结果1.160例NSCLC中,104例HECW1阳性表达,56例HECW1阴性表达。34例正常肺组织中,5例HECW1阳性表达,29例HECW1阴性表达。NSCLC患者癌组织中HECW1蛋白的阳性表达率（65.000%）远远高于正常肺组织中HECW1的阳性表达率（23.529%）（P＜0.001）。HECW1的表达与NSCLC患者的吸烟史、肿瘤大小、病理分期显著相关（P＜0.05）,与患者的年龄、性别、组织学类型、淋巴结转移及肿瘤位置无显著相关性（P＞0.05）。Kaplan-Meier分析显示HECW1高表达的NSCLC患者OS和PFS均显著差于HECW1低表达的患者（P＜0.001）。多因素Cox比例风险回归模型分析进一步显示,HECW1高表达是NSCLC患者预后的一个独立因素（P＜0.05）。2.和正常人支气管上皮细胞BEAS-2B相比,HECW1在NSCLC细胞株（H1299、A549、H460、H226）中的表达水平显著增加（P＜0.01）。HECW1在H1299细胞中的表达最低,在A549细胞中的表达最高,故本研究选择A549细胞和H1299细胞进行后续研究。3.QRT-PCR和western blot的结果显示,H1299细胞转染HECW1过表达载体后HECW1表达显著增加（P＜0.01）。细胞功能实验的结果显示,和对照组相比,转染HECW1过表达载体后,H1299细胞的增殖、迁移和侵袭均显著增加（P＜0.01）。4.QRT-PCR和western blot的结果显示,A549细胞转染HECW1干扰载体后HECW1表达显著减少（P＜0.01）。细胞功能实验的结果显示,和对照组相比,转染HECW1干扰载体后,A549细胞的增殖、迁移和侵袭均显著减少（P＜0.01）。5.QRT-PCR和western blot的结果显示,在H1299细胞中转染HECW1过表达载体后,smad4蛋白水平显著降低（P＜0.01）,其m RNA水平没有变化;在A549细胞中转染HECW1干扰载体后,smad4蛋白水平显著增加（P＜0.01）,其m RNA水平也没有变化。采用蛋白酶体抑制剂MG-132处理转染HECW1过表达载体的H1299细胞,western blot结果显示MG-132显著上调了HECW1下调的Smad4的蛋白水平。将Flag-HECW1和Myc-Smad4共转染H1299细胞,western blot结果显示HECW1明显促进Smad4蛋白的泛素化。6.在H1299细胞中同时过表达HECW1和Smad4,western blot的结果显示Smad4显著上调了HECW1下调的Smad4的蛋白水平（P＜0.01）。细胞功能实验的结果显示,和对照组相比,转染HECW1过表达载体后,H1299细胞的增殖、迁移和侵袭均显著增加（P＜0.01）,但是Smad4显著逆转了HECW1上调的细胞增殖、迁移和侵袭（P＜0.01）。结论1.HECW1在NSCLC癌组织中高表达。HECW1高表达的NSCLC患者OS和PFS较差,HECW1有望成为评估NSCLC患者预后的标志物。2.HECW1通过诱导Smad4的泛素化降解促进NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭。