【摘 要】
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猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis of swine virus,TGEV)及猪轮状病毒(Porcine rotavirus,Po RV)是引起仔猪腹泻的主要病毒。以PEDV的M基因,TGEV的N基因,Po RV的VP7基因为靶基因,设计特异性引物及不同荧光基团
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猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis of swine virus,TGEV)及猪轮状病毒(Porcine rotavirus,Po RV)是引起仔猪腹泻的主要病毒。以PEDV的M基因,TGEV的N基因,Po RV的VP7基因为靶基因,设计特异性引物及不同荧光基团标记的探针,建立针对这三种病毒的多重实时荧光定量PCR检测方法,并进行特异性、敏感性及重复性试验。结果显示:此检测方法灵敏性较强,对p MD18-PEDV-M、p MD18-TGEV-N和p MD18-Po RV-VP7检测下限分别为3.91×10~2copies/μL、8.39×10~1copies/μL和4.54×10~2copies/μL,灵敏度最低比常规PCR高出10倍;仅PEDV、TGEV、Po RV c DNA及阳性对照出现特异性扩增曲线,特异性良好;组内与组间变异系数均小于5%,有较好重复性。应用该检测方法进行临床样品检测,PEDV、TGEV及Po RV阳性率分别为52%、0.9%、1.5%,比常规PCR多检出10份阳性样本及4份混合感染阳性样本。大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)、沙门氏菌(Salmonella)和产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens,C.perfringens)可引起细菌性仔猪腹泻。为建立一种可以同时检测猪大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌的方法,试验分别针对大肠杆菌irp2基因、沙门氏菌fim Y基因、产气荚膜梭菌plc基因设计特异性引物和Taq Man探针,并对反应条件进行优化,建立了同时检测三种细菌的多重实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法对大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌的质粒标准品的最低检出限分别为9.28×10~3 copies/μL、3.09×10~3 copies/μL和4.37×10~3 copies/μL,灵敏度最低比常规PCR高10倍;仅特异性扩增大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌,对一些其它细菌无扩增曲线,有较强特异性;组内与组间变异系数均小于5%,有较好重复性。应用该检测方法进行临床样品检测,大肠杆菌、沙门氏菌及产气荚膜梭菌阳性率分别为55.4%、5.4%、7.1%,比常规PCR多检出6份阳性样本。基于PEDV M、TGEV N、PoRV VP7基因进行遗传进化分析,分析其基因核苷酸和氨基酸同源性以及进行了NJ系统发育树的构建,结果显示成功扩增11条PEDV M基因,均为G2型毒株;1条TGEV N基因;2条Po RV VP7基因,均为G9基因型。结果表明,吉林地区PEDV流行毒株为G2型,与G1型疫苗株CV777关系较远,TGEV流行毒株与疫苗株华毒株H亲缘关系较远,Po RV流行毒株为G9型,与G5型疫苗株分属不同血清型,可能导致疫苗免疫效果不理想。
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