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研究背景随着老龄化社会的推进,白内障发病人数在逐年上升,我国白内障患者大多为年龄相关性白内障（Age-related cataract,ARC）,目前手术仍然是治疗白内障最有效的手段。但由于手术费用昂贵,以及患者术后可能出现后发性白内障、眩光、老视等一系列问题。如能针对白内障的发病机制,应用药物来延缓和阻止白内障的发生、发展,将有效降低手术率,提高我国人口的健康水平和生活质量,并节省大量的人力和财力资源,降低社会发展的总体成本。长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）作为一种新型的非编码RNA,已成为各领域的研究热点。越来越多的证据表明,lncRNAs可以作为竞争性内源RNA（Competing endogenous RNA,ceRNAs）间接调节微小RNA（miRNAs）,从而在功能上释放其他RNA转录本。牛磺酸上调基因1（Taurineupregulates gene1,TUG1）最初在牛磺酸处理过的视网膜中表达上调,已被报道在多种肿瘤中广泛表达,它能促进细胞的增殖、分化、凋亡和迁移。然而,我们对其在白内障发病机制中重要性的认识仍然有限。我们课题组前期研究发现,在ARC患者的晶状体前囊膜组织中Smac/DIABLO（second mitochondria-derived activator of caspases/direct IAP binding protein with a low pI;designated here as Smac）呈现高表达,并且通过体外细胞实验证明了 Smac参与内质网应激途径调控的人晶状体上皮细胞（Human lens epithelial cells,HLECs）凋亡,下调Smac的表达能够抑制晶状体上皮细胞的凋亡。在进一步实验中我们发现在晶状体上皮细胞中,miR-29b与Smac的表达呈负相关,miR-29b表达上调后可以通过抑制Smac而减少晶状体上皮细胞的凋亡。利用生物信息学软件,我们预测到miR-29b与lncRNA-TUG1和Smac均存在结合位点。鉴于晶状体上皮细胞凋亡是年龄相关性白内障形成的细胞学基础,由此我们猜想:在年龄相关性白内障的发病过程中,lncRNA TUG1可能作为一种ceRNA,通过竞争性抑制miR-29b,在转录后水平调控人晶状体上皮细胞中Smac的表达,影响细胞凋亡信号传导通路。目的1.从组织学水平上研究lncRNATUG1、miR29b和Smac基因的表达异常与年龄相关性白内障的相关性。2.从细胞学水平探究lncRNA TUG1/miR-29b/Smac轴在年龄相关性白内障形成中的分子调控机制。3.在细胞凋亡模型中研究下调lncRNA TUG1对延缓白内障发生、发展的保护作用。方法第一部分收集临床组织样本,实验组选取年龄相关性皮质型白内障（Age-related cortical cataract,ARCC）、年龄相关性核型白内障（Age-related nuclear cataract,ARNC）和年龄相关性后囊下型白内障（Age-related posterior subcapsular cataract,ARPC）的晶状体前囊膜组织,每组各10例。同时选取10例年龄匹配的透明晶状体前囊膜组织做为对照组,qRT-PCR检测lncRNATUG1、miR-29b和Smac在不同组别样本中的mRNA表达水平差异。第二部分1.培养人晶状体上皮细胞系（HLE-B3）,利用lip2000转染pcDNA-TUG1至细胞,模拟lncRNATUG1的表达,转染pcDNA3.1空载体作为对照。筛选稳定转染的细胞系,qRT-PCR检测miR-29b的表达,Western-Blot检测Smac表达,流式细胞仪测定细胞凋亡率的变化,分别在RNA、蛋白质以及细胞学水平探讨lncRNATUG1在晶状体上皮细胞中的作用。2.生物信息学软件预测lncRNA TUG1、Smac与miR-29b的结合位点,构建野生型（Wild type,WT）报告基因载体TUG1-WT和Smac-WT。同时将结合位点碱基定点突变,构建突变型（Mutant,Mut）报告基因载体TUG1-Mut和Smac-Mut,将报告基因载体、内参质粒及miR-29b mimic共转染至HLE-B3细胞,利用双荧光素酶报告基因系统,明确lncRNA TUG1、Smac与miR-29b三者之间的特异性作用关系。3.胞核胞浆分离实验确定lncRNA TUG1在细胞中的定位分布。利用pcDNA-TUG1 模拟 lncRNA TUG1 的表达,miR-29b mimic 模拟 miR-29b 的表达,二者共转染至 HLE-B3 细胞,同时转染 pcDNA-NC（Negative control,NC）和miRNA mimic NC作为对照,Western-Blot检测两组中Smac蛋白表达水平的变化,AnnexinV/FITC双染色法及流式细胞术检测对细胞凋亡的影响。明确lncRNA TUG1对Smac基因及细胞凋亡的调控是否能够被miR-29b所阻断,即lncRNA TUG1是否在一定程度上,以miR-29b为介导对Smac基因及细胞凋亡进行调控。4.用CCK-8检测HLE-B3细胞在不同过氧化氢（H2O2）处理浓度下的细胞活力,选取 50%细胞抑制率（Median inhibitory concentration,IC50）下的 H2O2浓度作为最终筛选浓度,来构建人晶状体上皮细胞凋亡模型。随后在凋亡模型中转染sh-TUG1病毒干扰载体来抑制lncRNA TUG1的表达,在成功干扰lncRNA TUG1的细胞中,qRT-PCR检测miR-29b在mRNA水平的表达变化,Western-Blot 检测 Smac 在蛋 白水平的表达变化,AnnexinV/FITC 双染色法及流式细胞仪检测对细胞凋亡水平的影响。随后在该氧化应激模型中进一步研究下调lncRNA TUG1对白内障的发生、发展能否起一定的抑制作用。结果第一部分qRT-PCR检测ARCC、ARNC、ARPC组和透明晶状体前囊膜组织中lncRNATUG1、miR-29b和Smac基因的表达情况。结果显示:lncRNATUG1和Smac在不同类型ARC患者的晶状体前囊膜组织中的表达水平高于透明对照组。相比之下,miR-29b在不同类型ARC患者前囊膜组织中的表达量较透明对照组均明显降低。第二部分1.在HLE-B3细胞中转染pcDNA-TUG1后,Smac蛋白的表达水平及细胞凋亡率比转染pcDNA3.1空载对照组明显增高,而miR-29b的表达量却呈相反变化趋势。2.双荧光素酶实验结果显示,在miR-29b mimic存在的条件下,转染TUG1-WT和Smac-WT的人晶状体上皮细胞中,相对荧光素酶活性显著降低。而转染TUG-Mut和Smac-Mut的细胞中,相对荧光素酶活性无明显变化。在miR-29b mimic NC存在的条件下,转染TUG1-WT和Smac-WT的人晶状体上皮细胞中,其相对荧光素酶活性均未发生变化。3.胞核胞浆分离实验结果表明lncRNA TUG1主要分布在晶状体上皮细胞的胞质中,其分布并不受外界条件的影响而变化。共转染pcDNA-TUG1+miRNA mimic NC的细胞内,Smac蛋白的表达水平以及HLE-B3细胞的凋亡率比转染pcDNA-NC+miRNA mimic NC组升高;而在pcDNA-TUG1存在的情况下,转染 miR-29b mimic 后,pcDNA-TUG1+miR-29b mimic 组中 HLE-B3细胞内Smac蛋白的表达水平和细胞凋亡率比pcDNA-TUG1+miRNA mimic-NC组反而下降。4.最终筛选出合适的H2O2作用浓度为200μM,用该浓度的H2O2处理HLE-B3细胞24小时后,与未处理对照组相比细胞凋亡率接近50%。我们选择200μM H2O2作用HLE-B3细胞24小时作为后续实验的处理条件。qRT-PCR结果显示H2O2处理后的HLE-B3细胞中lncRNA TUG1的表达水平比正常对照组升高约1.5倍,而miR-29b的表达水平比正常对照组降低。Western blotting结果显示:经H2O2处理的HLE-B3细胞中,Smac蛋白的表达量是正常对照组的1.5倍。在H2O2诱导的晶状体上皮细胞凋亡模型中lncRNA TUG1、Smac和miR-29b的表达趋势与在年龄相关性白内障患者晶状体前囊膜中的表达趋势相同,凋亡模型构建成功。筛选出TUG1干扰表达（sh-TUG1）稳定转染细胞系后,用200μMH2O2处理HLE-B3细胞24小时,qRT-PCR结果显示,转染sh-TUG1组的HLE-B3细胞中miR-29b的表达量较sh-NC组增加;相反,Western blotting和流式细胞仪结果显示,转染sh-TUG1组的HLE-B3细胞中Smac蛋白表达水平和细胞的凋亡率均下降。结论1.在ARC和H2O2处理的晶状体上皮细胞中lncRNA TUG1和Smac表达上调,miR29b表达下降,提示上述分子的表达异常可能与年龄相关性白内障的发生相关。2.lncRNA TUG1在晶状体上皮细胞中作为一种ceRNA分子,通过抑制miR-29b来调控Smac的表达,影响人晶状体上皮细胞的凋亡。3.lncRNA TUG1基因下调可抑制晶状体上皮细胞凋亡,在一定程度上对延缓白内障的发生起保护作用。