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恶性肿瘤严重危害着人类的生命健康。目前,手术、化疗和放疗是其主要的治疗手段,但效果不佳,因此如何优化治疗方式成为目前主要挑战。随着基因工程的发展和分子生物学的应用,利用溶瘤病毒治疗肿瘤在近几十年得到迅速发展,被基因改造的病毒已被用于进行体内外抗肿瘤的疗效评估。溶瘤病毒（Oncolytic virus,OV）可在肿瘤细胞中选择性复制,且不需要整合宿主基因组,这使得其作为一种溶瘤制剂更安全,更有效,更具有吸引力。其中新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）是一种天然溶瘤病毒,在其选择性感染肿瘤细胞后,其可通过先天性和后天性免疫应答有效杀伤肿瘤细胞而不伤害正常细胞。现在,通过反向遗传技术可使NDV成为基因治疗的载体。通过插入各种外源治疗基因修饰病毒也可改善NDV的抗肿瘤能力,并且在一些动物模型和临床治疗试验中已取得较好疗效。Endoglin属于一种同源跨膜蛋白,主要表达于血管内皮细胞,特别是在肿瘤组织、再生组织以及炎症的新生血管内皮中。Endoglin在恶性肿瘤中表达明显升高,且其升高幅度与内皮细胞的增殖程度之间呈正相关性,而在其他细胞中的表达情况较弱。因此可以将Endoglin作为实体肿瘤血管靶向的目标分子。而单链抗体是免疫球蛋白最小的功能性结构单元,具有分子量小、穿透性强、免疫原性低等特点,可广泛用于诊断及治疗。因此本研究以新城疫病毒弱毒株Lasota为载体,构建出携带Endgolin单链抗体（Endoglin single chain antibody fragment,ENDscFv）基因的重组新城疫病毒,为重组溶瘤病毒抗肿瘤领域提供新思路。基于重组ENDscFv新城疫病毒的研究主要包括以下内容:目的:利用反向遗传技术构建携带ENDscFv的重组新城疫病毒。方法:本研究首先通过设计含有NDV Lasota载体Pme I酶切位点上下游同源序列的特异性引物,用于目的基因ENDscFv的PCR扩增,再通过Pme I酶酶切出线性化的Lasota载体,将PCR扩增出的目的基因片段与线性化的Lasota病毒载体经过同源重组的方式进行连接后,立即将连接产物转化至DH5α感受态细胞中,后在含氨苄青霉素的固体培养基平板上涂匀。待单克隆菌落长出后,挑取单克隆菌落在30℃条件下震荡培养12-16 h后进行质粒提取,随即将质粒进行Pme I酶切和1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,将条带疑似正确的质粒进行PCR扩增出正确条带后,送至上海生工生物工程公司测序,将测序拼接后的结果通过NCBI BLAST进行比对检测序列是否正确。将验证正确的重组质粒进行大提提高浓度并去内毒素后,使用脂质体lipo2000转染试剂与NDV核蛋白（NDV-Nucleocapsid,NDV-N）、磷蛋白（NDV-Phosphoprotein,NDV-P）和大聚合酶蛋白（NDV-Large polymerase,NDV-L）辅助质粒同时转染乳仓鼠肾细胞BSR,以拯救出重组病毒。通过注射转染细胞上清,利用9-11日龄鸡胚大量扩增病毒,收取鸡胚尿囊液进行鸡红细胞凝集实验验证是否拯救成功,将血凝试验呈阳性的尿囊液运用Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction（RT-PCR）技术和测序技术检测目的基因片段是否成功插入。确认拯救出重组病毒后,通过将重组病毒与BSR细胞共孵育观察细胞病变情况,计算重组病毒的半数组织培养感染剂量(50%Tissue Culture Infective Dose,TCID50)。在体外用重组病毒与人肝癌Hep G2细胞、人肺腺癌A549细胞和人正常肝脏L02细胞共培养,通过间接免疫荧光验证La-ENDscFv在细胞中的复制能力。将MOI=1的Lasota和重组新城疫病毒La-ENDscFv感染Hep G2肿瘤细胞,同时设置PBS对照组,在光学显微镜下观察细胞病变情况。通过细胞增殖试验检测Lasota和La-ENDscFv对人肝癌Hep G2细胞的杀伤作用。建立SCID鼠Hep G2皮下瘤模型,通过尾静脉注射病毒Lasota和La-ENDscFv,研究重组病毒的体内抗肿瘤作用。结果:1,使用PCR扩增得到目的基因ENDscFv片段和Pme I酶切得到线性化的Lasota载体,将目的基因与载体进行同源重组连接后,1%琼脂糖凝胶电泳得到疑似正确条带,通过质粒PCR和酶切验证均正确,公司测序结果与目的基因序列在NCBI BLAST网站比对一致,证明重组质粒La-ENDscFv已成功构建;2,通过BSR细胞转染,鸡胚扩增及血凝试验证实成功拯救出重组病毒,提取鸡胚尿囊液进行RT-PCR凝胶电泳及测序鉴定,表明ENDscFv基因成功插入Lasota病毒基因组中;3,通过与BSR细胞共孵育,计算出重组新城疫病毒的50%组织细胞感染量(Tissue Culture Infective Dose,TCID50)为10-4.51/100μL,体外的间接免疫荧光实验证实La-ENDscFv在人肝癌Hep G2细胞和人肺腺癌A549细胞中可以选择性复制,而在人正常肝脏L02细胞中复制受到限制,用MOI=1的Lasota和La-ENDscFv感染人肝癌Hep G2细胞48h后,在显微镜下可观察到细胞出现明显变小变圆,细胞间连接变少的病变情况,从CCK-8试验结果可以看出,和PBS组相比,Lasota和La-ENDscFv可以抑制Hep G2细胞的增殖;4,在SCID鼠Hep G2皮下瘤模型中,通过小鼠体重和小鼠肿瘤体积的测量后发现:所有组中的小鼠在整个研究期间没有显示出明显的差异和体重的损失;和PBS、Lasota组相比,La-ENDscFv组小鼠肿瘤生长速度最慢。结论:本实验通过同源重组技术成功构建了携带ENDscFv基因的重组质粒,并通过脂质体转染技术拯救出了携带ENDscFv基因的重组新城疫病毒La-ENDscFv;La-ENDscFv能在人肿瘤细胞A549和Hep G2中选择性复制,而在人正常L02细胞中复制受到限制;La-ENDscFv可使人肝癌Hep G2细胞发生病变,抑制Hep G2细胞的增殖;在SCID鼠Hep G2皮下瘤模型中,所有组中的小鼠在整个研究期间没有显示出明显的差异和体重的损失,La-ENDscFv对SCID鼠体内Hep G2肿瘤的抑制效果强于Lasota。