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背景:有研究结果表明,正常的细胞组织在体外培养时可以正常生长和分裂。但经过一段时间后,细胞就会失去生长和分裂的能力,最后走向衰老死亡,这样的现象便限制了对细胞的研究。但是永生化的细胞能够为细胞、肿瘤、组织工程等领域的研究奠定实验基础。因此,怎样才能使体外正常状态下目的细胞成为永生化的细胞成为研究者们研究的重点。研究发现,端粒酶的活性主要受TERT基因调控,当TERT活性增加时,将促进端粒酶利用自身作为模板合成端粒DNA,来弥补染色体复制造成的端粒长度的损失。使细胞获得无限增殖能力,从而实现细胞永生化的目的。因此也可以说明TERT的活性是使细胞永生化的关键。本实验我们发现,通过脂质转染法能将外源hTERT基因转染进目的细胞内来提高hTERT的表达量,也能通过CRISPR/dCas9与TERT的转录激活因子结合的方法来提高内源细胞TERT的表达。目的:通过病毒感染的方法将带有hTERT的慢病毒感染原代细胞,或者使用脂质体转染法将hTERT慢病毒载体转染进原代细胞,使原代细胞中外源hTERT表达量上升,来促进端粒酶的活性,进而维持染色体端粒的长度,使正常状态下快速死亡的原代细胞生长周期变长甚至永生化。或者利用CRISPR/dCas9激活系统技术激活原代细胞的内源性TERT基因的表达,通过验证了原代细胞内源TERT的表达量的上升这一结果,为后续永生化细胞使用提供新的思路和方法。方法:通过构建hTERT慢病毒载体,然后将hTERT包装成慢病毒去感染原代细胞或者使用脂质体法将外源hTERT转染进原代细胞,来提高原代小鼠成纤维细胞内hTERT的表达。另一种方法是通过CRISPR/dCas9与转录激活因子结合的系统的方法验证是否能够提高原代细胞内源性TERT的表达量,若验证成功后,可将此载体包装成病毒感染原代细胞使细胞成为永生化。结果:本实验构建含有hTERT编码基因(CDS)的慢病毒载体转染293T细胞,最终用Real-Time PCR检测实验组293T细胞中hTERT含量显著上升。我们将hTERT包装成慢病毒,流式细胞术测到病毒滴度高达4.8*10~8TU/ML,hTERT慢病毒感染293T细胞有很高的感染率,但是感染原代细胞却并未成功,这方面有待研究。本实验也将外源基因hTERT通过脂质体转染法转染进原代小鼠成纤维细胞中,Real-Time PCR方法检测到原代细胞内hTERT表达量显著上升。寻找新的方法激活内源TERT基因,为之后获得稳定激活TRET的永生化细胞奠定基础,我们使用了CRSPR/dCas9(无核酸内切酶活性的Cas9)与转录激活剂结合的系统促进细胞内源基因的表达的方法。因此,本实验采用CRSPR/dCas9与转录激活剂结合的系统,将TERT的重要的转录调控因子SP1基因与dCas9的C端结合,同时设计相应的SgRNA,通过脂质体转染方法分别将该两个基因编辑载体转染进293T细胞和原代细胞,来提高原代细胞内源TERT基因的表达,Real-Time PCR检测到阳性293T细胞和阳性原代小鼠成纤维细胞中内源TERT基因都有5倍多的提高。验证此种方法有效性后也可将该载体包装成病毒,通过病毒转染细胞得到稳定的永生化细胞,此方法由于时间原因并没有进行后续慢病毒的包装,但是为永生化细胞的实验提供了新的思路综上所述,我们优化了慢病毒包装条件,并成功构建了hTERT过表达载体,成功构建的CRISPR/dCas9载体与转录激活因子SP1融合的dCas9-SP1载体。由于包装的hTERT慢病毒滴度或者纯度不够,无法感染原代细胞,但是对293T的感染性很好。通过脂质体转染pLenti-hTERT进入原代细胞中Real-Time PCR检测hTERT表达量显著提高。CRISPR-dCas9-SP1载体和42230-SgRNA-mouse-EGFP共转染到原代小鼠成纤维细胞中通过Real-Time PCR检测到内源TERT表达量显著的提高,为以后研究细胞永生化提供了新的思路。