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目的 根据血管内皮生长因子受体（VEGFR）在肿瘤组织血管内皮表达的特异性及颗粒酶B（granzyme B,GraB）诱导细胞凋亡的作用，本课题采用基因工程技术，研制以血管内皮生长因子（VEGF）分子结构域肽段引导，GraB为效应因子，VEGFR为靶分子的融合蛋白，使该蛋白通过血管内皮生长因子（VEGF）与VEGFR的识别，特异性地作用于新生血管内皮细胞，诱导内皮细胞凋亡，探讨重组VEGF结构域与Grab融合蛋白是否具有破坏新生血管的功能。建立VEGF结构域与GraB融合基因逆转录病毒转移体系，观察其对大肠癌细胞的杀伤作用，探讨转VEGF结构域与GraB融合基因治疗肿瘤的可行性。 方法首先抽提人外周血淋巴细胞总RNA，进行RT-PCR克隆GraBcDNA，构建其原核表达载体；接着抽提LoVo细胞总RNA，进行RT-PCR克隆VEGF结构域cDNA，构建VEGF结构域原核表达载体；进一步构建VEGF结构域与GraB融合基因原核表达载体。VEGFD-GraB载体用限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定，接着IPTG诱导表达，SDS-PAGE和免疫印迹法分析表达产物，再通过亲和层析法纯化重组蛋白。VEGF结构域多肽和VEGF结构域与GraB融合蛋白用人脐静脉内皮细胞（ECV304）和鸡胚尿囊膜血管测定其生物学活性。将VEGF结构域与GraB融合基因cDNA亚克隆到逆转录病毒载体pLNCX2中，经PT67包装细胞包装，产生含VEGF结构域与GraB融合基因的逆转录病毒。此病毒感染细胞株LS-174T，流式细胞仪检测细胞凋亡情况． 结果SDS-PAGE分析显示，表达产物均以可溶性分子形式存在于菌体中。重组蛋白均可用亲和层析法纯化。Western blot表明表达产物均具有良好的抗原性和特异性。VEGF结构域多肽和VEGF结构域与GraB融合蛋白具有抑制血管内皮细胞增殖及鸡胚尿囊膜血管形成的活性，后者效果更佳，能破坏鸡胚尿囊膜血管生成。VEGF结构域与GraB融合基因的逆转录病毒上清转染大肠癌细胞株LS-174T，LS-174T培养上清和细胞内Western blot均检测出一条分子量约为39ku的蛋白带（颗粒酶B单抗为一抗）。而重组逆转录病毒原液转染的靶细胞未见特异性条带，流式细胞仪检测LS-174T细胞株出现特异的凋亡峰。 结论 建立了GraB原核表达系统，重组蛋白GraB大量获得将对于 研究其结构与功能有重要意义，为其制各级生产奠定了基础。VEGF结 构域原校表达系统和VEGF结构域与GraB融合蛋白的原核表达系统的 建立为他们在肿瘤生物靶向治疗奠定了基础。VEGF结构域与GraB融合 基因逆转录病毒转移体系，为转GraB基因治疗肿瘤提供了依据。