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青虾,学名日本沼虾(Macrobrachium niponense) 广泛分布于全国各地。青虾是我国重要的淡水养殖虾类,养殖年产量约25万吨,养殖年产值超过100亿元。青虾雄性生长速度快于雌性,收获期规格也大于雌性。但由于迄今尚不了解青虾性别调控(涉及性别决定和性腺分化)的分子机制,建立大规模养殖全雄青虾的技术是困难的。正因为如此,开展青虾性别决定和性腺分化(生殖)的分子机制的研究十分重要。本实验已经构建青虾促雄性腺转录组和精巢、卵巢基因表达谱,为性别或生殖相关基因的筛选提供了理论指导。本文筛选了 Feminization-1 homolog b、Nitric oxide synthase、glycogen debranching enzyme、2 个 Serine protease inhibitor 共 5 个性别或生殖相关的候选基因,进行全长cDNA克隆及其时空表达模式分析,藉此确定其是否参与性别决定或生殖过程,以推动青虾性别调控分子机制的研究。Feminization-1 homolog b(Fem-1b)基因参与雄性动物的发育调控,在线虫性别控制中发挥着关键的作用,但在青虾中未见报道。为了研究青虾性别决定机制,本文克隆获得青虾Fem1b基因cDNA序列并研究其时空表达规律。成体组织表达分析显示,Fem-1b基因在所有组织中均有表达,在精巢中表达最高。雌雄不同组织表达结果显示,Fem-1b表达水平具有雌雄两态性,雄性组织表达水平显着高于雌性各组织表达水平(P<0.05),表明Fem-1b可能参与青虾的生殖调控。不同发育时期表达结果发现,变态后第10天Fem-1b基因表达水平显着升高(P<0.05)。组织学切片研究显示,促雄腺在变态后第10天开始分化,出现索状结构,推测Fem-1b基因同时也参与促雄腺的分化发育。一氧化氮(Nitric Oxide,NO)是一种新型的细胞信使分子,大量研究发现NO合酶(Nitric oxide synthase, NOS)可以通过催化L-精氨酸为L-瓜氨酸来合成NO。NOS已在脊椎动物和无脊椎动物被广泛研究,但在青虾中未见研究报道。本文克隆获得青虾NOS基因cDNA序列并研究其组织表达规律。成体组织表达分析结果显示,NOS基因在所有组织中均有表达,在促雄腺中表达最高,说明NOS在雄虾性别决定过程中可能发挥着重要的功能。不同发育时期表达结果发现,变态后第10天NOS基因表达水平显着升高(P<0.05)。由于促雄腺在变态后第10天开始分化,因此推测NOS基因也与促雄腺的分化发育过程。糖原脱脂酶(Glycogen debranching enzyme,AGL)是参与糖原降解的一种复合酶,包括α-葡聚糖转移酶和淀粉-1,6-葡糖苷酶、脱支酶两种功能。我们采用RACE技术克隆获得青虾AGL基因cDNA序列长5451 bp,编码1707个氨基酸;5’非编码区为327bp,3’非编码区为256bp。生物信息学分析AGL分子量为189.3kDa,等电点为5.93。生物信息学分析预测青虾AGL蛋白包含Pfam等典型结构域。不同成体组织和不同发育时期表达结果发现AGL表达水平均很高,其可能的功能有待进一步研究。Serine protease inhibitors (Serpins)广泛存在于体内,参与多种生物学过程例如凝血淋巴,激活,激发抗菌肽的合成等。本文从青虾精巢中克隆了 Serine protease inhibitors(Serpins)家族中的两个基因,命名为MnSERPIN1和MnSERPIN2。青虾MnSERPIN1和MnSERPIN2基因全长cDNA序列长分别为1879和1788bp,分别编码413 and 416个氨基酸。生物信息学分析MnSERPIN1分子量为45.57 kDa,等电点为8.99,MnSERPIN1分子量为45.75 KDa ,等电点为8.55。不同组织表达结果显示,MnSERPIN1基因在各组织中均有表达,但在精巢中表达最高;MnSERPIN2基因只在精巢中表达。以上研究结果表明Serpin1和Serpin2可能在青虾雄性生殖中发挥着重要的作用。