糖基转移酶基因β3GnT8和β3GnT2在CD147诱导MMPs表达细胞信号转导途径中的作用

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目的:研究糖基转移酶基因(β3GnT8和β3GnT2)在CD147诱导MMPs表达细胞信号转导途径中的作用;研究糖基转移酶基因(β3GnT8和β3GnT2)催化合成的多聚乳糖胺糖链和细胞外基质金属蛋白酶诱导因子CD147在人胃癌和人胶质瘤组织的表达及其临床意义;研究60Co-γ辐照对肿瘤细胞中糖基转移酶和多聚乳糖胺糖链变化的影响。方法:(1)将β3GnT8RNA干扰载体pSilenCircle-T8Si、对照载体pSilenCircle-T8Scr、β3GnT8和β3GnT2真核正义表达载体pEGFP-C1-T8S与pEGFP-C1-T2S及空载体pEGFP-C1通过脂质体转染三种肿瘤细胞株(人神经胶质瘤细胞株U251、人胶质母细胞瘤细胞株LN229和人胃癌细胞株SGC-7901),并通过G418筛选出稳定细胞株。(2)荧光显微镜观察转入荧光载体的细胞株,RT-PCR和West blotting检测β3GnT8和β3GnT2基因水平和蛋白水平的表达,鉴定转染效果。(3)流式细胞术和免疫荧光实验分析G418筛选出稳定细胞株中,β3GnT8和β3GnT2基因水平和蛋白水平表达变化的同时,细胞表面多聚乳糖胺糖链表达变化。(4)下调糖基转移酶基因β3GnT8的在肿瘤细胞中的表达水平,以及采用衣霉素和3’-叠氮胸腺嘧啶处理肿瘤细胞株,Western blotting监测HG-CD147在肿瘤细胞株的表达变化,从而分析糖基转移酶基因β3GnT8、衣霉素和3’-叠氮胸腺嘧啶对HG-CD147蛋白水平表达的影响。(5)RT-PCR检测衣霉素对MMP-2表达的影响;流式细胞术检测衣霉素对细胞周期的影响。(6)采用STRING数据库分析CD147和MMPs相互作用关系以及CD147和MMPs三维结构模型。(7)在已制作肿瘤组织芯片,检测肿瘤组织芯片中多聚乳糖胺糖链和CD147的表达。(8)60Co-γ辐照肿瘤细胞后,Western blotting分析糖基转移酶的变化,流式细胞术分析多聚乳糖胺糖链的变化。结果:(1)通过荧光显微镜观察、RT-PCR和Western blotting检测,载体成功转入细胞,得到稳定转染细胞株。(2)流式细胞术和免疫荧光实验检测发现,上调β3GnT8的表达,则多聚乳糖胺糖链结构表达量增多;下调β3GnT8的表达,则多聚乳糖胺糖链结构减少。(3)Western blotting分析表明:①CD147在U251和SGC-7901细胞中,CD147含有HG-CD147和LG-CD147两种结构;②衣霉素可以诱导在U251和SGC-7901细胞产生一条没有糖基化的CD147片段;③在LN229和SGC-7901细胞中,下调β3GnT8表达,HG-CD147蛋白水平降低;④随着3’-叠氮胸腺嘧啶浓度逐渐增加, HG-CD147蛋白水平表达量逐渐降低。(4)RT-PCR分析发现,经过衣霉素处理后,与对照组相比,MMP-2几乎不表达。(5)流式细胞术检测细胞周期实验发现衣霉素主要有规律地作用于细胞周期中的G1期,随着衣霉素浓度的逐渐增高,%G1的值也逐渐增多。(6)采用STRING数据库分析表明,CD147与MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-9、MMP-11和MMP-14都具有相互作用,CD147具有3个N-连接的糖基化位点(Asn160、Asn268、Asn302)。(7)成功制作人胃癌组织、癌旁非肿瘤胃组织以及人胶质瘤组织芯片。(8)在胃癌中多聚乳糖胺糖链的表达要强于正常胃粘膜上皮细胞,在弥漫型胃癌中多聚乳糖胺糖链的表达要强于肠型胃癌。由人胶质瘤组织芯片结果看出,人胶质瘤细胞中也高表达多聚乳糖胺糖链。(9)CD147表达在胃癌细胞的胞浆和胞膜中,呈棕黄色颗粒状,在正常胃粘膜上皮细胞中几乎无表达。CD147在人胶质瘤细胞中也高表达。(10)随着60Co-γ射线剂量逐渐增加,West blotting检测表明β3GnT8蛋白水平表达逐渐降低,流式细胞术进行分析表明细胞表面多聚乳糖胺糖链结构表达水平逐渐降低。结论:(1)成功构建β3GnT8及β3GnT2上调及下调细胞株。(2) β3GnT8具有催化合成多聚乳糖胺糖链结构的能力。(3)衣霉素对于CD147是一种非常灵敏的N-连接糖链合成抑制剂,可以诱导细胞株产生一条没有糖基化的核心蛋白—CD147。(4)β3GnT8和β3GnT2可以调节HG-CD147上多聚乳糖胺糖链的表达,调节HG-CD147蛋白水平表达。(5)由于3’-叠氮胸腺嘧啶能够抑制HG-CD147的合成,从而可以抑制MMP-2的表达,抑制肿瘤的生长。因此可以推论出:治疗艾滋病的药物3’-叠氮胸腺嘧啶可能具有抗肿瘤活性。(6)衣霉素对MMP-2的表达有重要的影响。它有规律地影响细胞周期的G1期。(7)CD147与MMP-1、MMP-3、MMP-7、MMP-9、MMP-11和MMP-14之间可能均存在一定的细胞信号转导联络通路。(8)多聚乳糖胺和CD147均高表达于人胃癌和人胶质瘤组织。(9)β3GnT8和多聚乳糖胺糖链的表达对60Co-γ射线比较敏感,β3GnT8和多聚乳糖胺糖链的表达与60Co-γ射线剂量成负相关。
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