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背景:乳腺癌是一种威胁全球女性生命健康的恶性肿瘤,而恶性肿瘤的标志之一是肿瘤侵袭转移,肿瘤患者90%以上的致死率都是由转移引起的。乳腺癌是一种由肿瘤细胞和间质细胞等组成的高度复杂的微环境系统,肿瘤细胞能产生高水平的活性氧（Reactive oxygen species,ROS）,作用于基质成纤维细胞使其产生氧化应激进而影响肿瘤细胞基因组的稳定性;间质细胞能够通过分泌一些生长因子来调节肿瘤的发生发展,并在肿瘤的发生发展以及转移过程中发挥着重要的作用。成纤维细胞能够在肿瘤微环境中被激活并转化为肿瘤相关成纤维细胞（Cancer-Associated Fibroblasts,CAFs）,CAFs是肿瘤间质中最丰富的细胞成分,能够通过启动肿瘤细胞上皮间质转化（Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）促进肿瘤的增殖、侵袭和转移,但是其具体机制尚不明确。EMT被认为是肿瘤侵袭转移的关键步骤,转化生长因子-β1（TGF-β1）信号通路是肿瘤细胞发生EMT的经典通路,TGF-β1还是潜在的自噬激活剂,能够促进纤维化的产生。课题组前期研究发现,TGF-β1能诱导血清饥饿处理的成纤维细胞的自噬,在CAFs形成的过程中扮演着至关重要的角色。那么TGF-β1是通过何种机制诱导CAFs形成?CAFs促进乳腺癌侵袭转移的机制又是如何呢?这值得我们进一步的探讨。目的:1.研究乳腺癌微环境中肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）形成的机制。2.研究肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）对乳腺癌侵袭转移的影响,探讨CAFs促进乳腺癌侵袭转移的机制。方法:1.采用MTS法检测成纤维细胞NIH3T3存活率,酶标仪微板法检测MDA含量、SOD活力,流式细胞术检测ROS含量。2.运用RT-qPCR、Western blotting法检测α-SMA、FAP-α、Cav-1、Beclin1、LC3β、E-Cadherin、N-Cadherin的mRNA和蛋白表达水平。3.使用透射电镜技术观察细胞自噬结构、激光共聚焦技术检测FAP-α与LC3β的共定位情况。4.采用细胞划痕、Transwell侵袭转移实验考察小鼠乳腺癌细胞4T1迁移侵袭能力。5.利用siRNA技术特异性干扰FAP-α的表达。6.运用成纤维细胞NIH3T3与4T1细胞建立混合接种移植瘤模型。结果:1.100μM H2O2预处理成纤维细胞NIH3T3 24h后,细胞存活率在50%-70%之间,细胞呈现出良好的敏感性,细胞的MDA含量及ROS含量显著升高,细胞SOD活力显著下降（P<0.05）,造成了成纤维细胞NIH3T3氧化应激。2.2.5 ng/mL的TGF-β1显著提高了H2O2预处理的NIH3T3细胞存活率及SOD活力,并显著降低了MDA及ROS的含量,缓解了细胞的氧化损伤。此外,TGF-β1显著上调了H2O2预处理的NIH3T3细胞α-SMA、FAP-α的mRNA及蛋白表达,并显著下调小窝蛋白Cav-1的mRNA及蛋白表达,提示TGF-β1促进H2O2预处理的成纤维细胞NIH3T3向CAFs转变。3.TGF-β1显著上调了H2O2预处理的NIH3T3细胞Beclin1、LC3β的mRNA及蛋白表达,并促使LC3I型蛋白向LC3II型的转变,而自噬促进剂RaPa进一步增强了TGF-β1的作用,自噬抑制剂3-MA则相反。经H2O2预处理的NIH3T3细胞出现了包裹受损线粒体的自噬小体,而且TGF-β1增加了经H2O2预处理的NIH3T3细胞自噬小体的产生,并且缓解了线粒体损伤。此外,TGF-β1提高了经H2O2预处理的NIH3T3细胞FAP-α与LC3β的表达且FAP-α与LC3β的共定位增强,而自噬抑制剂3-MA阻断了TGF-β1的作用。以上结果表明TGF-β1可能通过自噬促进H2O2预处理的NIH3T3细胞向CAFs转变。4.NIH3T3细胞培养上清（CM）培养4T1细胞24小时后,含TGF-β1的CM显著提高肿瘤细胞的愈合百分比,并明显提高了肿瘤细胞的侵袭、转移数。5.在NIH3T3细胞与4T1细胞共培养体系中,含TGF-β1的CM组显著下调了E-Cadherin的蛋白表达并上调N-Cadherin的蛋白表达,而自噬促进剂RaPa进一步增强TGF-β1的作用,自噬抑制剂3-MA则相反。以上结果提示TGF-β1可能是通过刺激成纤维细胞发生自噬形成CAFs,从而促进肿瘤细胞的侵袭转移。siRNA特异性干扰FAP-α的表达后,肿瘤细胞的侵袭和转移数明显减少,并使EMT发生反转,显示TGF-β1可能是通过促进CAFs的形成来促进EMT的进程,从而促进了肿瘤细胞的侵袭转移。6.NIH3T3细胞与4T1细胞混合接种后肿瘤的体积及瘤重均显著增加,混合移植瘤的坏死面积减少,并丰富了CAFs标志物α-SMA和FAP-α及自噬标志物Beclin1和LC3βmRNA的表达;上皮标志物E-Cadherin的mRNA及蛋白表达均显著降低,间质标志物N-Cadherin的mRNA和蛋白表达均显著提高;以上结果提示在动物的混合移植瘤内,成纤维细胞能够向CAFs转化并促进肿瘤的EMT过程,除此以外,细胞混合接种后增加了肿瘤向肺部转移,进一步说明了成纤维细胞能够转变为CAFs从而启动EMT进而促进肿瘤的侵袭和转移。结论:1.TGF-β1可能通过自噬缓解氧化应激状态下成纤维细胞NIH3T3的氧化损伤并促进肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）的表型形成。2.TGF-β1可能通过诱导CAFs的形成从而启动上皮-间质转化（EMT）进而促进肿瘤的侵袭转移。3.4T1:NIH3T3=1:2混合接种能够促进肿瘤的生长及肺转移。