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第一部分:TFAP2E甲基化水平与胃癌氟尿嘧啶类药物疗效的临床相关性观察目的:探究胃癌组织和癌旁正常组织中转录因子激活蛋白2E（transcription factor activator protein2E,TFAP2E）的甲基化水平以及TFAP2E甲基化率与氟尿嘧啶类药物疗效的相关性。方法:运用甲基化敏感性高分辨率熔解曲线（methylation-sensitive high-resolution melting,MS-HRM）技术,对112例胃癌组织标本及76例癌旁正常胃粘膜组织标本行TFAP2E甲基化率的检测,比较两组标本中TFAP2E发生甲基化的频率。使用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）,判断 TFAP2E 甲基化率的最佳界值,分析TFAP2E甲基化水平高低与胃癌患者临床病理特征之间的相关性。在收集的112例胃癌病例中,36例为Ⅳ期患者,接受以氟尿嘧啶类药物为基础的方案化疗,均具备明确的化疗疗效评价,对该部分患者的胃癌组织行免疫组化法,检测TFAP2E表达水平,分析TFAP2E表达量及甲基化水平与氟尿嘧啶类药物疗效的相关性。结果:1、胃癌组织中TFAP2E甲基化的发生率为96.4%（108/112）,而癌旁正常胃黏膜组织为69.7%（53/76）,前者TFAP2E甲基化的发生率明显高于后者（χ2=16.258,P＜0.001）;2、运用ROC曲线,结合胃癌组织及其配对的癌旁组织TFAP2E的甲基化率的具体数值,确定40.25%为甲基化率的最佳界值,判定TFAP2E甲基化率≥40%为高甲基化,而TFAP2E甲基化率＜40%被认定为低甲基化;3、单因素相关分析显示:TFAP2E甲基化水平高低与患者的性别、年龄、临床分期、淋巴结受累、分化程度、病变部位、远处转移等均无相关性（P＞0.05）;4、在36例接受含氟尿嘧啶类药物化疗的Ⅳ期胃癌患者中,化疗疗效与患者的年龄、性别、淋巴结受累、临床分期、分化程度、病变部位、远处转移均无关（P＞0.05）,而与TFAP2E甲基化水平相关（χ2=4.702;P=0.03）,进一步采用二元logistic回归分析,提示胃癌患者的TFAP2E高甲基化与氟尿嘧啶类药物耐药相关（OR=6.333,P=0.046）;5、胃癌组织中,TFAP2E甲基化状态与TFAP2E蛋白表达呈负相关。结论:TFAP2E在胃癌组织中发生甲基化的频率显著高于癌旁正常胃黏膜组织;在Ⅳ期胃癌中,TFAP2E高甲基化与氟尿嘧啶类药物的耐药具有一定的相关性。第二部分:外泌体miRNAs在TFAP2E高甲基化致5-Fu耐药中的作用目的:检测转录因子激活蛋白 2E（transcription factor activator protein2E,TFAP2E）在胃癌细胞MGC803及其耐药细胞MGC803/5-Fu中的甲基化水平,分析两组细胞外泌体miRNAs的表达差异,并探究TFAP2E高甲基化在胃癌细胞对5-Fu耐药中的分子机制。方法:构建胃癌耐药细胞MGC803/5-Fu,采用甲基化敏感性高分辨率熔解曲线（methylation-sensitive high-resolution melting,MS-HRM）技术,检测胃癌细胞 MGC803及其耐药细胞MGC803/5-Fu的甲基化水平,qRT-PCR检测TFAP2E mRNA表达水平,Western Blot检测TFAP2E蛋白表达情况。采用超高速离心的方法提取MGC803和MGC803/5-Fu细胞的外泌体,其形态与大小使用透射电子显微镜观察,外泌体特异性蛋白的表达运用Western Blot技术进行检测。采用miRNAs测序技术检测胃癌细胞MGC803及其耐药细胞MGC803/5-Fu的外泌体miRNAs表达谱,筛选出差异表达的miRNAs。提取MGC803/5-Fu细胞的外泌体（5-Fu/exo）,并用PKH26行染色标记,用激光共聚焦显微镜观察MGC803摄取5-Fu/exo的过程,摄取成功后,采用CCK8法检测MGC803对5-Fu敏感性的变化,q-PCR检测差异miRNAs的表达变化。此外,将TFAP2E转染至耐药细胞MGC803/5-Fu后,比较转染前后TFAP2E甲基化水平及表达情况的变化、差异miRNAs的表达变化以及5-Fu敏感性的改变。结果:1、与MGC803细胞相比,MGC803/5-Fu细胞中,TFAP2E甲基化水平更高,TFAP2E 的表达水平更低（P＜0.05,P＜0.05）,且 MGC803 较 MGC803/5-Fu 对5-Fu的敏感性更高（P＜0.05）;2、外泌体在透射电子显微镜下呈现双层膜结构,大小约为30-100nm。外泌体特异性蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）。3、miRNAs测序结果显示:miR-106a-5p和miR-421表达差异最显著,在MGC803/5-Fu细胞外泌体内的表达量分别是MGC803细胞的38.433倍和24.133倍;4、MGC803成功摄取MGC803/5-Fu的外泌体（5-Fu/exo）后,miR-106a-5p和miR-421表达较摄取前显著上调（P＜0.01,P＜0.01）,但5-Fu的敏感性较摄取前显著下降（P＜0.01）,TFAP2E甲基化水平和TFAP2E表达水平无差异（P＞0.05）;5、耐药细胞MGC803/5-Fu成功转染TFAP2E后,TFAP2E mRNA及蛋白表达水平较转染前显著升高（P＜0.01,P＜0.01）,miR-106a-5p和miR-421表达较转染前显著下调（P＜0.01,P＜0.01）,5-Fu的敏感性比转染前升高（P＜0.01）,而TFAP2E甲基化水平无明显变化。结论:胃癌细胞中,TFAP2E高甲基化与5-Fu耐药具有相关性。TFAP2E高甲基化导致其蛋白表达水平下调,进而上调外泌体miR-106a-5p和miR-421表达水平,最终导致胃癌细胞对5-Fu耐药。第三部分:外泌体miR-106a-5p/EGR2调控TFAP2E高甲基化相关性氟尿嘧啶类药物耐药的机制研究目的:研究miR-106a-5p在胃癌细胞外泌体及胃癌患者血清外泌体中的表达情况,并通过对其下游靶基因的预测,进一步探究TFAP2E高甲基化致胃癌氟尿嘧啶类药物耐药的可能分子机制。方法:收集上述Ⅳ期胃癌患者首次化疗前的血清标本,并提取血清外泌体,用透射电子显微镜观察外泌体的形态与大小,运用Western Blot技术检测胃癌患者血清外泌体特异性蛋白的表达。采用miRNAs测序技术检测化疗敏感组与化疗耐药组胃癌患者的血清外泌体miRNAs表达谱,筛选出差异表达显著的miRNAs,并与细胞实验筛选出的miRNAs取交集,交集miRNAs采用qRT-PCR方法进行验证。验证后的miRNAs运用生物信息学工具预测其下游靶基因,并做GO分析及KEGG通路分析。对TFAP2E行蛋白互作分析,互作蛋白对应的基因与上述miRNAs预测的靶基因取交集,筛选出与TFAP2E存在互作关系的下游靶点,并采用qRT-PCR及Western Blot技术在胃癌组织及胃癌细胞中进行验证。qRT-PCR检测Ⅳ期胃癌患者的血清外泌体miR-106a-5p及胃癌组织中EGR2表达水平,并做miR-106a-5p表达量、EGR2表达量及TFAP2E甲基化率三者相关性统计分析。结果:1、透射电子显微镜下,血清外泌体呈囊泡状,直径约50-150nm,囊泡边缘电子密度较高,颗粒感明显。外泌体特异性蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）。2、对提取的血清外泌体miRNAs行测序分析:共筛选出692个差异倍数＞2倍的miRNAs,其中上调的miRNAs468个,下调的miRNAs 224个。上调的468个miRNAs与本研究第二部分筛选的差异上调的miRNAs取交集,筛选出在耐药患者血清外泌体和耐药细胞外泌体中均差异性上调的miRNAs6个:miR-296-5p、miR-200c-3p、miR-202-3p、miR-421、miR-133a-5p、miR-106-5p;3、上述 6 个 miRNAs 预测的靶基因行 GO分析及KEGG通路分析,提示靶基因富集于癌症相关通路。4、TFAP2E蛋白互作分析结果与上述6个miRNAs靶基因预测结果行交集,提示:FOXJ3、EGR2、E2F3可能与TFAP2E相互作用,且EGR2、E2F3均为miR-106a-5p下游靶基因。5、耐药患者组织中EGR2的mRNA及蛋白表达水平明显低于敏感患者的组织（P＜0.05,P＜0.05）,而E2F3在两组中表达无明显差异（P＞0.05）,EGR2和E2F3的mRNA及蛋白表达水平在MGC803/5-Fu细胞中显著低于MGC803细胞（P＜0.01）。6、miR-106a-5p表达量、EGR2表达量及TFAP2E甲基化率三者行统计学分析:等值线图提示EGR2表达极低值位于高miR-106a-5p、高TFAP2E甲基化率区域,EGR2表达极高值位于低miR-106a-5p、低TFAP2E甲基化率区域。三者矩阵图可见miR-106a-5p与EGR2表达水平更相关。敏感组及耐药组分别做散点图示:两组miR-106a-5p表达水平均与TFAP2E甲基化率呈正相关,两组miR-106a-5p表达水平均与EGR2表达水平呈负相关。三者气泡图结果表明:EGR2在耐药组的表达显著低于敏感组。结论:TFAP2E高甲基化可能通过上调miR-106a-5p,抑制靶基因EGR2的表达,从而导致胃癌氟尿嘧啶类药物耐药。