目的:　　 肝性脑病是继发于急、慢性肝功能衰竭或严重慢性实质性肝疾病的一种神经精神综合征。显性的肝性脑病主要的临床表现为意识障碍、行为失常和昏迷。急性的肝性脑病表现为突然发作的精神错乱，谵妄、惊厥，继而昏迷，其死亡率高达80-90％。肝性脑病患者氨水平增高在致脑水肿起了重要作用。因此研究氨进入脑中枢的机制以及在脑实质细胞中的转运对肝性脑病的发生及演变的研究有着十分重要的意义。　　 氨转运体为一类近来发现的专性转运氨的蛋白，在原核细胞、真菌类和哺乳动物都有表达，为AMT/MEP/RH蛋白。其在大鼠中表达为RhAG、RhD、RhBG和RhCG蛋白，在体内各器官起转运氨作用的为后两种蛋白。目前研究认为RhBG和RhCG蛋白在肾脏远端肾小管上皮细胞、集合管上皮细胞、睾丸精索上皮细胞、肝细胞、十二指肠上皮细胞和脑中枢都有表达。然而其分布和机制并不十分明确，有待深入的研究。本研究的目的为制作一个有效的急性肝衰竭的动物模型，研究动物模型中脑实质氨浓度的变化，并研究RhBG和RhCG蛋白在动物模型中的定位、表达、调控机制以及对氨浓度变化的作用。　　 材料和方法:　　 1、动物模型制备　　 选择雄性SD大鼠75只，体重220±20克，按照随机数字表进行完全随机化的方法5组:1组:生理盐水对照组(2ml/kg生理盐水，iv)，5只;2组:LPS对照组(32μg/kg脂多糖，iv)，5只;3组:D-GalN对照组(800mg/kg D氨基半乳糖，iv)，5只;4组:急性肝衰竭组(G/L组，800mg/kg D氨基半乳糖联合32μg/kg脂多糖，iv)50只。将G/L组设置5个时间点，分别为2h、6h、9h、12h、24h。G/L组9h设置10只大鼠，12h、24h设置15只，其余各时间点均设置5只。5组:anti-TNFαIgG单克隆抗体组（抗体组，anti-TNFαIgG5mg/kg，iv，G/L组药物注入前30给药）10只。剖腹、断头剪取肝右叶组织及脑组织用于形态学检查。剪取1mm×1mm×1mm脑组织，放入2.5％戊二醛固定液中，用于脑组织免疫电镜检查其余脑组织-80℃保存。　　 2、血清肝功能检测　　 应用生物化学方法检测血清丙氨酸氨基转移酶、总胆红素水平，以明确爆发性肝衰竭时肝脏功能生化学改变。　　 3、脑实质氨及血浆氨检测　　 脑实质氨及血浆氨按照Biovision试剂盒说明书检测，在分光光度计于570 nm波长处检测数值，计算。　　 4、肝脏HE染色　　 各组动物取肝脏组织行HE染色以明确肝脏病理。　　 5、脑组织切片电镜观察　　 电镜观察肝衰竭大鼠脑组织以明确脑组织病理变化。　　 6、脑组织RhBG和RhCG免疫组化　　 采用免疫组化SABC法检测各组脑组织RhBG和RhCG蛋白的定位及表达。　　 7、Western blot、RT-PCR检测RhBG、RhCG mRNA和蛋白表达　　 采用Western blot、RT-PCR方法检测各组脑组织RhBG和RhCG mRNA和蛋白表达。　　 8统计学处理　　 采用SPSS13.0统计学软件对相关数据进行分析，数据以均值±标准差(X±S)表示，计量资料各组间的比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。　　 结果:　　 1、G/L组大鼠肝坏死的发生　　 G/L组大鼠在给药后9h时出现死亡，于12h时死亡率达53.3％(8/15)，24h死亡率达67.7％。NS组、LPS组、GalN组大鼠未见死亡。G/L组大鼠造模后12小时ALT、TBiL水平显著高于NS组(p＜0.01)，肝脏病理提示肝细胞大块坏死，条索状结构消失，纤维间隔塌陷，无再生肝细胞，大面积红细胞浸润。Anti-TNFαIgG的使用使得肝衰竭大鼠的死亡率降至20％，且有效的缓解ALT、TBiL水平的增高及肝脏病理。和NS组相比，LPS组ALT水平有所增高(p＜0.05)。提示800mg/kgD氨基半乳糖联合10μg/kg脂多糖尾静脉给药，可有效的致使大鼠产生药物性肝衰竭。　　 2、大鼠急性肝衰竭模型的确立　　 急性肝衰竭是指在肝实质病变基础上，早期发作肝性脑病。在G/L组大鼠，给药后12小时死亡率高达53.3％。在G/L组大鼠给药后12小时，脑实质氨水平较NS组增高有显著意义(3361.6±1307.4nnol/g vs1986.7±214.8 nnol/g，P＜0.05)，电镜发现胶质细胞出现明显的水肿。提示G/L组大鼠给药后12小时发生肝性脑病的病理的基础，确定此时大鼠急性肝衰竭模型的成立。Anti-TNFαIgG的使用可使得大鼠脑实质氨水平接近于NS组(2491.2±984.1 vs1986.7±214.8 nnol/g, P＞0.05)。　　 3、大鼠急性肝衰竭模型RhBG和RhCG的表达改变　　 RhBG、RhCG蛋白为一种膜表达的氨转运体蛋白。免疫组化发现各组RhBG、RhCG蛋白表达于神经元细胞膜，未见于胶质细胞表达。和NS组相比，RhBG、RhCG蛋白在G/L组（给药后12小时）神经元染色较深。RhBG表达于脑内皮细胞腔侧，未见于表达于实质侧;在G/L组（给药后12小时），RhBG蛋白染色较深，表达明显增加。RhCG在NS组脑内皮细胞没有染色，未见表达;在G/L组（给药后12小时），RhCG蛋白在脑内皮细胞腔及间质侧可见表达。而在LPS组和GalN组，RhBG、RhCG蛋白较为淡染。在LPS组和GalN组，RHBG蛋白在血管腔侧淡染，RhCG蛋白未见血管染色。RhBG、RhCG蛋白在anti-TNFαIgG组神经元细胞膜及血管处染色变淡，蛋白表达减少。　　 G/L组给药后6小时RhBG蛋白表达增加，随时间增加而表达增加，至12h达顶点，然后逐渐下降(p＜0.05)。G/L2h组、LPS组、D-GalN组RhBG蛋白表达增加效果不明显(p＞0.05）。　　 G/L组给药后2小时RhCG蛋白表达增加，随时间增加而表达增加，至12h达顶点，然后逐渐下降(p＜0.05)。LPS组、D-GalN组RhCG蛋白表达增加效果不明显(p＞0.05)。　　 RhBG、RhCG基因表达随着时间的进展呈上升趋势，12小时为顶点，12小时点后呈下降趋势。G/L组2h、6h、9h、12h、24h各时间点RhBG、RhCG mRNA表达与正常值相比差异有显著性(p＜0.05)。LPS组、GalN组RhBG、RhCG mRNA表达与正常值相比差异无显著性(p＞0.05)。　　 Anti-TNFαIgG组RhBG蛋白和RhCG蛋白较正常组差异显著，增高明显(RHBG,P＜0.05; RhCG, P＜0.01)。与G/L12h组相比，anti-TNFαIgG组呈下降趋势，差别具有显著意义(P＜0.05）。　　 Anti-TNFαIgG组RhBG和RhCG mRNA较正常组差异显著，增高明显(P＜0.01）。与G/L12h组相比，anti-TNFαIgG组呈下降趋势，差别具有显著意义(P＜0.01)　　 结论:　　 1、雄性SD大鼠LPS32μg/kg联合D-GalN400mg/kg尾静脉给药12h可以诱导急性肝衰竭模型。肝衰竭大鼠发现大脑实质氨水平明显升高。　　 2、正常大鼠中，RhBG和RhCG蛋白分布于神经元细胞膜。RhBG蛋白可分布于脑内皮细胞腔侧。在肝衰竭大鼠模型中，氨转运体RhCG蛋白在肝衰竭大鼠脑中枢血管腔侧和间质侧出现的高表达和RhBG在血管腔增加表达，其综合效应对氨进入脑实质侧起着转运的作用。RhBG和RhCG蛋白在肝衰竭大鼠神经元细胞膜的高表达，则起着排出氨的作用，对神经元起着解毒的作用。血管RhCG蛋白的表达可介导氨进入脑中枢。　　 3、在急性肝衰竭大鼠中TNFα增加RhBG和RhCG蛋白的表达，并促使氨进入脑中枢，这一效果，可以被anti-TNFαIgG所阻断。使用anti-TNFαIgG后，爆发性肝衰竭大鼠氨转运体RhBG和RhCG蛋白表达减少，从而减少氨进入脑中枢，更进一步支持RhBG和RhCG蛋白在脑中枢血管表达介导氨进入脑中枢。