研究背景及研究目的:胰腺导管腺癌(PDAC)是恶性程度最高的肿瘤之一,预后极差,5年生存率低于5%。导致预后较差的一个主要因素是缺乏准确的早期诊断方法,患者被诊断时多数已处于晚期,并且发生转移,手术切除并不能改善生存率,即使术后辅助化疗也并不能有效延长患者的生存时间,主要原因是PDAC具有广泛的化疗药物耐药性。吉西他滨是一种用于治疗晚期或转移性胰腺癌的类嘧啶药物,可单独或与其他化疗药联合使用,PDAC获得吉西他滨抗性是患者生存率低的另一个重要因素。因此,深入理解PDAC吉西他滨耐药的分子机制,鉴定PDAC吉西他滨耐药的新标志物对于克服PDAC的不良预后具有重要意义。Kruppel样因子4(KLF4)是一种含锌指结构的转录因子,在多种组织中广泛表达。KLF4在维持细胞周期和基因组完整性中起关键作用。KLF4在不同类型的肿瘤中均呈现表达下调或缺失,例如结直肠癌,膀胱癌和胃癌。KLF4过度表达明显抑制体内结肠癌和胃癌细胞的致瘤性。然而,在乳腺癌细胞中抑制KLF4促进p53表达,引起p53依赖性细胞凋亡。高达70%的乳腺癌被检测到高水平的KLF4。在胰腺癌中,KLF4阳性调控p27基因激酶抑制蛋白1(p27Kipl)的表达,并在体外和体内抑制胰腺癌的生长和转移,表明KLF4在胰腺癌中具有肿瘤抑制功能。然而,KLF4α上调被证明可促进胰腺癌细胞周期进程,减少胰腺癌患者生存时间。因此,KLF4在PDAC的确切作用尚不清楚,是否参与PDAC吉西他滨耐药性有待研究。上皮间质转化(EMT)表型与化疗或放射抗性之间存在密切联系。奥沙利铂耐药的结直肠癌细胞、紫杉醇耐药的卵巢癌细胞、他莫昔芬耐药的乳腺癌细胞以及吉非替尼耐药的肺癌细胞均能够产生EMT表型,即上皮粘附因子E-钙粘蛋白(E-Cadherin)表达降低,间质标志物如波形蛋白(Vimentin)、α平滑肌激动蛋白(α-SMA)和纤连蛋白(fibronectin)表达增加。这些研究结果充分将化疗药物耐药性与EMT联系起来。吉西他滨耐药的胰腺癌细胞也能够产生EMT表型,Notch信号通路在这个过程中其关键作用。E盒结合锌指蛋白1(ZEB1)作为EMT的激活剂,能够触发上皮细胞向间充质细胞的表型转化,这是癌细胞获得侵袭性表型的过程。然而,近期研究表明,在PDAC中抑制EMT并不会改变侵袭性PDAC的产生,但促进癌细胞增殖以及核苷转运蛋白的表达,从而增强PDAC吉西他滨敏感性,增加小鼠的总生存期。相反,ZEB1介导的EMT能够增强PDAC细胞的多重耐药性,靶向抑制ZEB1部分削弱了 PDAC细胞对吉西他滨、5氟尿嘧啶和顺铂的敏感性。这些结果说明,ZEB1和EMT在肿瘤药物耐药性中的作用仍存争议。因此,研究ZEB1在PDAC吉西他滨耐药中的作用,证实ZEB1表达水平是否与PDAC吉西他滨耐药性正相关具有重要的临床意义。微小RNA(miRNA)是一种长度为20至22个核苷酸的非蛋白质编码RNA。miRNA通过与靶基因mRNA的3,非翻译区(3’UTR)的互补序列结合,导致mRNA的降解,抑制基因表达。miRNA的表达已经被认为是许多正常生物过程不可分割的组成部分,例如细胞增殖、分化和凋亡。miRNA的异常表达与癌症的发生和发展密切相关。在肝癌中,KLF4的表达与miR-153、miR-506和miR-200b的表达呈正相关。miR-153、miR-506和miR-200b分别靶向EMT相关因子snail1、Slug和ZEB1的mRNAs的3’UTR,从而抑制snail、Slug和ZEB1的表达。在不同类型的肿瘤细胞中,例如乳腺癌细胞、结肠癌细胞和PDAC细胞,miR-200家族成员(miR-141和miR-200c)通过靶向ZEB1和ZEB2的mRNA的3’UTR抑制EMT。ZEB1作为转录因子反向抑制miRNA-200家族成员miR-141和miR-200c的转录,表明miR-200家族成员和ZEB1相互反馈抑制。ZEB1同时抑制miR-183的表达。MiR-183是位于人染色体7q31-34位点的miR-182-96-183基因簇的一员,在人结直肠癌、乳腺癌以及膀胱癌中均表达上调,但在肺癌、成视网膜细胞瘤中表达下调。这些结果表明miR-183的作用是具有细胞依赖性的。MiR-183在PDAC组织和细胞中呈低表达,这与肿瘤分级、转移以及TNM分期显著相关。MiR-183的表达与miR-200家族成员的表达密切相关。MiR-183和miR-200家族成员共同靶向抑制B细胞特异性白血病病毒插入位点1(Bmi1)表达从而影响PDAC细胞的干细胞表型。MiR-183和miR-200通过靶向Wnt/β-catenin信号通路从而抑制EMT。此外,在吉西他滨耐药的PDAC细胞中miR-200家族成员的表达是下调的,但吉西他滨是否影响miR-183的表达仍未可知。本研究通过吉西他滨作用PDAC细胞分析吉西他滨对KLF4和ZEB1表达的影响;通过干扰或过表达KLF4和ZEB1明确KLF4和ZEB1在PDAC细胞吉西他滨敏感性中的作用,分析KLF4和ZEB1对miR-200b和miR-183表达的影响;通过构建KLF4过表达PDAC裸小鼠模型,研究体内过表达KLF4对PDAC吉西他滨敏感性的影响以及对ZEB1表达的影响;收集PDAC临床标本,分析吉西他滨药物敏感性,检测KLF4和ZEB1在吉西他滨敏感和抵抗的PDAC组织中的差异表达,确定KLF4和ZEB1在PDAC吉西他滨耐药的预警作用。研究方法1.体外实验:①吉西他滨作用人PDAC细胞系BxPC-3,Panc-1和M1Apaca-2,CCK8细胞增殖实验和流式细胞分析检测吉西他滨对PDAC细胞的抑制作用,western blot和荧光定量PCR分析吉西他滨对KLF4和ZEB1表达的影响。②PDAC细胞中干扰或过表达KLF4,western blot分析KLF4的表达对ZEB1表达的影响,western blot和荧光定量PCR分析KLF4表达对miR-200b和miR-183表达的影响,CCK8细胞增殖实验检测KLF4表达对PDAC细胞吉西他滨敏感性的影响。③染色质免疫共沉淀(ChIP)检测KLF4对miR-200b和miR-183启动子的结合能力,荧光素酶报告基因实验检测KLF4对miR-200b和miR-183启动子活性的调控作用。④荧光素酶报告基因实验检测miR-200b和miR-183与ZEB1的3’UTR的相互作用。⑤PDAC细胞中干扰ZEB1表达,western blot分析Caspase 3的激活,CCK8细胞增殖实验检测抑制ZEB1表达对PDAC细胞吉西他滨敏感性的影响。2.体内实验:购买4～6周龄的BALB/c裸小鼠。Panc-1细胞转染空白慢病毒或者过表达KLF4慢病毒,荧光显微镜检测转染效率。将1×107个生长良好的Panc-1细胞(转染空白慢病毒或过表达KLF4慢病毒)与100μl的PBS/基质胶(1:1,v/v)混匀,注射到小鼠两侧腋窝皮下。注射一周后,通过腹膜内注射吉西他滨(80mg/kg;q3天),持续6周。每周使用游标卡尺测量肿瘤的长轴(L)和短轴(S),肿瘤体积如下计算:V=(L×S2)×π/6。在最后一次注射后二十四小时处死小鼠,剥离肿瘤组织用于随后的分析。免疫组化和western blot 分析 KLF4 和 ZEB1 的表达。3.临床标本:收集PDAC组织,分离原代细胞,LDH检测实验分析细胞吉西他滨药物敏感性,将PDAC组织分类为吉西他滨敏感、部分敏感和抵抗。荧光定量PCR、western blot和免疫组化分析吉西他滨敏感PDAC和吉西他滨抵抗PDAC中KLF4和ZEB1的表达差异。研究结果1.体外实验:结果显示,吉西他滨作用PDAC细胞,抑制KLF4表达,同时,抑制miR-200b和miR-183的表达,但促进了 ZEB1表达。KLF4敲低抑制miR-200b和miR-183的表达,促进了 ZEB1的表达,反之,KLF4过表达促进miR-200b和miR-183的表达,抑制了 ZEB1的表达,说明KLF4阳性调节miR-200b和miR-183的表达,负向调节ZEB1的表达。此外,KLF4敲低增强吉西他滨耐药,而KLF4过表达削弱吉西他滨耐药。ChIP实验证实KLF4能够直接结合miR-200b和miR-183的启动子,荧光素酶报告试验确定KLF4能够阳性调节miR-200和miR-183的启动子活性。miR-200b和miR-183通过靶向ZEB1的3’UTR区域直接抑制ZEB1表达。ZEB1敲低增加了 PDAC细胞吉西他滨敏感性。这些研究结果表明,KLF4/miR-200b/miR-183/ZEB1信号通路调节了 PDAC细胞的吉西他滨耐药性。2.体内实验:将过表KLF4的PDAC细胞接种到BALB/c裸小鼠腋窝处,一周后即可在接种处扪及结节,一周至两周生长较慢,随后呈快速生长。相比于对照组,KLF4过表达并没有明显影响肿瘤的生长,但明显增加了吉西他滨药物敏感性。免疫组化和western blot证实体内过表达KLF4抑制了 ZEB1表达。线性回归分析显示KLF4表达与ZEB1表达呈负相关。这些结果表明KLF4过表达通过负调节ZEB1表达削弱体内PDAC的吉西他滨耐药。3.临床标本:收集41例PDAC组织,LDH法鉴定13例为吉西他滨敏感,7例为吉西他滨抵抗,21例为部分敏感。我们选取了 7例表现为吉西他滨抵抗的PDAC和7例吉西他滨敏感的PDAC,荧光定量PCR、western blot和免疫组化证实吉西他滨抵抗的PDAC中KLF4的表达明显低于吉西他滨敏感的PDAC,而ZEB1在吉西他滨抵抗的PDAC中的表达明显高于吉西他滨敏感的PDAC。这些结果表明KLF4与ZEB1的表达可能作为PDAC吉西他滨耐药性的新的标志物。结论1.KLF4 通过结合 miR-200b 和 miR-183 的启动子,促进 miR-200b 和 miR-183的表达,miR-200b和miR-183直接靶向ZEB1的3’UTR抑制ZEB1的表达。抑制ZEB1表达增加了 PDAC细胞吉西他滨敏感性。2.体内过表达KLF4抑制ZEB1的表达,增加了 PDAC吉西他滨药物敏感性。3.KLF4在吉西他滨抵抗的PDAC中的表达明显低于吉西他滨敏感的PDAC,而ZEB1在吉西他滨抵抗的PDAC中的表达明显高于吉西他滨敏感的PDAC,KLF4和ZEB1的表达可能作为PDAC吉西他滨耐药性的新的标志物。