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第一部分Oligofectamine介导转录因子SP1反义及诱骗性寡核苷酸转染猪内皮细胞系条件的优化研究【目的】研究拟探索确定高效、稳定的转录因子SP1反义及诱骗性寡核苷酸( AS-ODN及decoy ODNs )在oligofectamine介导下转染猪血管内皮细胞系(SV-40-PED)的最佳转染条件和效果,为以转录因子为靶点的基因治疗在抑制异种排斥反应中的应用奠定基础。【方法】针对猪α1,3GT基因上游调控序列中4个特异启动子中的启动子B,设计并生物合成数条寡核苷酸分子(AS-ODN、decoy ODNs及错配ODNs),运用oligofectamine转染体系转染永生化猪血管内皮细胞系SV-40-PED。分别应用流式细胞仪和显微荧光技术,同时测定细胞乳酸脱氢酶(LDH)的含量评价各组PEC的摄取情况以及寡核苷酸分子脂质体转染对PEC生长的影响情况。【结果】SV-40-PED在oligofectamine的介导下可以摄取SP1 AS-ODN及SP1 decoy ODNs。在6孔培养板中,当SP1 decoy ODNs终浓度为250nM、转染26 h时,转染效率最佳,其摄取率为(93.37±0.85%),荧光强度为(200.30±12.22);同时细胞毒性相对较低(乳酸脱氢酶含量为(49.61±17.13)U/L);此时细胞内荧光物质主要聚集于细胞核。而错配组与阴性对照组相比未见明显不同。【结论】Oligofectamine转染体系是一种高效、低毒的寡核苷酸转染方式。SP1 ODNs终浓度为250 nM、转染26 h时可以为猪内皮细胞系的转染提供良好效果。本研究为以转录因子为靶点的基因治疗在抑制异种排斥反应中的应用奠定了良好基础。第二部分转录因子SP1反义及诱骗性寡核苷酸对猪内皮细胞α半乳糖苷链表达的影响【目的】本研究旨在进一步评价SP1 AS-ODN及SP1 decoy ODNs对猪内皮细胞α1,3-GT基因及α-Gal蛋白表达的影响。【方法】SP1反义(SP1 AS-ODN)及诱骗性寡核苷酸(SP1 decoy ODNs)转染猪血管内皮细胞系,细胞爬片后荧光显微镜下观察α半乳糖糖链(αGal)抗原表位的表达;蛋白印迹法(Western blot)检测蛋白表达情况;流式细胞学检测转染后猪血管内皮细胞系膜蛋白αGal的表达;RT-PCR法检测SV-40-PED转染前后α1,3半乳糖转移酶(α1,3GT) m RNA。【结果】荧光显微镜下细胞爬片可见转染组(SP1 decoy ODNs组)细胞膜荧光表达明显减弱,部分部位可见点状荧光缺损。Western blot显示decoy ODNs /PED的αGal的相对吸光度值为(48.2±0.9),仅为空转染组(只含有转染试剂oligofectamine)(91.6±1.7)的52.6% (P < 0 .05)。转染组α1,3GT基因异构体的mRNA表达量(异构体1,0.42±0.20;异构体2,0.27±0.12)显著低于空转染组(异构体1,0.72±0.17;异构体2,0.50±0.19 ;p均< 0.05) ,但错配组(错义decoy ODNs组)及空转染组相比差异无统计学意义( P > 0.05)。【结论】SP1 decoy ODNs可以靶向性抑制猪内皮细胞系αGal基因的表达,为抑制超急性排斥反应的研究提供了新的思路和策略。第三部分转染后猪血管内皮细胞系与抗人血清补体细胞毒作用的实验研究【目的】本研究旨在成功建立对猪血管内皮细胞系SV-40-PED靶向转染的基础上,拟用猪血管内皮细胞系和人血清建立超急性排斥反应(HAR)体外模型,探讨TF decoy技术处理后的猪内皮细胞结合抗体/补体能力的变化以及是否具有抗人血清补体介导的细胞毒作用。【方法】在抗体/补体与SV-40-PED结合实验中,运用流式细胞仪检测decoy ODNs转染处理SV-40-PED后结合抗体/补体能力的变化,并通过乳酸脱氢酶(LDH)释放实验评价TF decoy技术对人血清细胞毒效应的保护作用。【结果】流式细胞学检测中,decoy ODNs组与空转染组相比,无论抗体还是补体结合水平均有不同程度的下降,抗体/补体下降程度依次为IgM 68.0%,IgG 56.1%,C3c 55.1%(P < 0.05)。20%正常人血清(normal human serum, NHS)及40%NHS对空转染组和错配组SV-40-PED均有不同程度的杀伤能力,而decoy ODNs转染SV-40-PED后即可呈现出对此效应的保护作用,与空转染组相比,20%NHS组和40%NHS组其靶细胞溶解率分别下降15.0%和30.2% (P<0.05),表现为补体对SV-40-PED的杀伤率不同程度的下降。空转染组和错配组间杀伤率无明显差异(P>0.05),热灭活正常人血清(heat-inactivated NHS, HINHS)作为阴性对照对各组SV-40-PED均表现出背景毒性作用。【结论】在体外补体介导的细胞毒反应中,decoy ODNs转染猪内皮细胞SV-40-PED可以呈现出其保护作用。第四部分转染后猪血管内皮细胞系与人外周血单个核细胞之间的作用研究【目的】建立人外周血单个核细胞和猪血管内皮细胞的共培养研究模型,在体外模拟异种移植物内皮细胞与人血清相互作用的过程,探讨decoy ODNs在人PBMC对猪血管内皮细胞单向混合培养实验中的影响。【方法】SV-40-PED转染后分别运用氚3-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)法和MTT法检测人外周血单个核细胞和猪血管内皮细胞共培养模型中人PBMC的增殖情况,探讨人外周血单个核细胞与转染前后猪内皮细胞相互作用的变化。【结果】未加入刺激细胞的人外周血单个核细胞增生微弱,加入经丝裂霉素C处理的异种刺激细胞SV-40-PED后,各组人外周血单个核细胞均分裂增生,并在5～7d左右逐渐达到最大。在共培养第5天,3H-TdR法检测显示decoy ODNs转染组的cpm值的下降程度为空转染组的67.1%,空转染组和错配组的组间比较无明显差异(P <0.05)。decoy ODNs转染处理SV-40-PED后第5天,MTT法显示人PBMC的增殖能力仅为空转染组的39.2% (P < 0.05),呈现出对猪血管内皮细胞的保护作用。【结论】在人外周血单个核细胞和猪血管内皮细胞的共培养研究模型中,decoy ODNs转染处理SV-40-PED可以部分抑制人PBMC的增殖。