【摘 要】
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人源程序性死亡因子-配体1（Human programmed death factor-ligand 1,PD-L1）是一种重要的肿瘤标志物,通过对细胞、组织、外周血等样品中PD-L1蛋白含量的检测,可以为癌症的早期诊断、免疫疗法的预后等提供依据。目前PD-L1蛋白的检测多是基于抗体的酶联免疫吸附法,此方法为固液界面的多相反应,结合动力学较慢,反应时间长,而且蛋白翻译后修饰会对抗体的结合产生位阻,
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人源程序性死亡因子-配体1（Human programmed death factor-ligand 1,PD-L1）是一种重要的肿瘤标志物,通过对细胞、组织、外周血等样品中PD-L1蛋白含量的检测,可以为癌症的早期诊断、免疫疗法的预后等提供依据。目前PD-L1蛋白的检测多是基于抗体的酶联免疫吸附法,此方法为固液界面的多相反应,结合动力学较慢,反应时间长,而且蛋白翻译后修饰会对抗体的结合产生位阻,降低灵敏度。为了更好地进行PD-L1检测,本研究以新型PD-L1探针的开发为目的,进行了以下研究和应用探索。1.扩培本实验室构建的稳定表达PD-L1蛋白的菌株,IPTG诱导重组蛋白表达,超声破碎菌体,脲溶解包涵体,通过镍琼脂糖凝胶分离纯化得到目的蛋白,最后透析除盐、蛋白复性使目的蛋白接近天然构象,得到分子量约为35 k Da、浓度约为2.14 mg/m L的重组PD-L1蛋白。2.以分离纯化的PD-L1重组蛋白作为靶标,运用SELEX方法筛选PD-L1蛋白特异性核酸适配体。对富集的第26轮文库进行高通量测序,分析测序结果,依据同源性将序列划分为不同的家族,从中挑选代表序列,合成并添加荧光标记,用于后序表征。通过流式细胞术比较待选序列的特异性,挑选出特异性最好的MJ5序列进行结构优化,得到一条33个碱基PD-L1蛋白特异性核酸适配体MJ5C,用流式细胞术对该序列的亲和力进行表征。对适体与靶标的结合进行分子动力学模拟。3.对筛选得到的特异性核酸适配体的应用性进行探索,通过共聚焦显微成像方法和组织芯片成像方法检测MJ5C对细胞、组织水平PD-L1蛋白表达情况的检测能力,证明本研究筛选得到的PD-L1蛋白特异性核酸适配体MJ5C可以应用于细胞、组织水平PD-L1蛋白的定位、定性、定量检测。4.以核酸适配体作为识别探针,建立了基于仿生磁性纳米颗粒的循环肿瘤细胞分型联合捕获系。应用不同探针对循环肿瘤细胞表面E-钙黏蛋白、波形蛋白的定量识别,实现肿瘤细胞的分型,并提高捕获率。本研究开发得到的PD-L1蛋白特异性核酸适配体MJ5C,以及建立的CTC联合分型捕获系统,在肿瘤早期检测、肿瘤治疗方案制定、预后监测等方面具有广阔的应用前景。
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