目的白念珠菌广泛存在于大多数健康人的皮肤和黏膜表面,是临床上常见的条件性致病真菌。由于机体免疫系统的限制,白念珠菌一般情况下处于定植状态,并不引起症状,但当机体免疫力、生理机能和(或)定植部位原有微生物群落发生变化时,可能会导致机体无法继续将定植的菌体限制于定植状态,因此可能会导致感染性疾病的发生。白念珠菌感染包括浅表局部感染和系统性感染,前者包括口腔、皮肤、阴道处的念珠菌病,后者为全身性感染,包括血流、内部脏器的感染,严重的系统性感染可致命,即使应用了抗真菌药物,病死率仍然居高不下,且会增加医疗花销。由于癌症的积极治疗、HIV感染的增加、器官移植的普遍、侵入性医疗器械的广泛应用和广谱抗生素的过多使用,致使白念珠菌感染发病率不断增高,成为全球性健康问题。但是目前为止白念珠菌的致病机制仍不完全明确,抗真菌药物的种类有限、抗菌谱窄、毒副作用大及耐药性增加,这使得临床抗白念珠菌感染的治疗十分受限。因此,进一步研究阐明白念珠菌的致病机制,从而探索抗白念珠菌药物新靶点和研制新的治疗方法十分必要。白念珠菌是一种多态性真菌,可以呈现酵母、假菌丝和菌丝三种形态生长,其中只有酵母态和菌丝态在感染发生发展中起不同的作用。侵袭上皮细胞是白念珠菌重要的毒力因素,通过诱导内吞和主动穿透两种不同的形式侵袭上皮细胞,前者是通过菌体表面的侵袭素结合上皮细胞表面受体E-cadherin,从而激活上皮细胞内吞白念珠菌,该过程是一个被动的过程,不需要菌体的活性。目前为止共发现两种侵袭素Als3和Ssa1,Als3和Ssa1结合上皮细胞表面受体E-cadherin,通过一种内涵素依赖的机制诱导内吞。通过主动穿透侵袭上皮细胞是一个菌体主导的主动过程,需要有活性的白念珠菌菌丝,因此菌丝形成在此过程中起重要作用。白念珠菌通过侵袭素诱导上皮细胞将其内吞的过程受Ras1-cAMP-PKA信号通路的调控,ALS3基因的表达受转录因子Efg1的影响,而Efg1是在Ras1-cAMP-PKA信号通路的下游,该转录因子发挥作用受PKA活性的影响。课题组前期研究发现,白念珠菌缺失SPT20基因后毒性明显下降,该基因可以调控白念珠菌菌丝形成和生物膜形成。从其可以影响菌丝形成过程可以推测该基因将对白念珠菌通过主动穿透侵袭上皮细胞产生影响,那么SPT20基因能否影响白念珠菌通过诱导内吞侵袭上皮细胞呢?如果该基因对白念珠菌诱导上皮细胞内吞有调控作用,那么是通过何种通路或机制?是否与侵袭素、Ras1-cAMP-PKA信号通路相关?为解决这些科学问题,在课题组前期研究的基础上,通过研究不同白念珠菌菌株与肺上皮细胞A549的相互作用,进一步探索了 SPT20基因的功能和发挥这些生物功能的分子机制。方法1.上皮细胞内吞白念珠菌实验应用YPD液体培养基在30℃、200rpm条件下培养白念珠菌获得对数生长期的酵母,RPMI 1640+10%胎牛血清作为完全培养基在37℃、5%CO2条件下培养A549细胞,用完全培养基37℃、200rpm震荡培养白念珠菌90min可以获取菌丝相的白念珠菌。将白念珠菌菌丝与A549细胞在完全培养基中37℃、5%CO2共培养50min,用PBS冲洗细胞爬片后4%多聚甲醛固定,之后用含BSA、甘氨酸的PBST封闭,用耦合有FITC的兔抗白念珠菌抗体标记位于上皮细胞外处于黏附状态的白念珠菌,Triton X-100通透A549细胞后用钙荧光白标记黏附和内吞的白念珠菌。正置荧光显微镜观察并计数。2.白念珠菌杀伤上皮细胞实验应用细胞毒性LDH检测试剂盒检测白念珠菌对A549细胞的杀伤程度,通过检测培养基中LDH浓度作为评价死细胞和受损细胞数量的指标。首先做预实验确定最佳A549细胞用量,然后进行研究所需的正式实验。培养不同白念珠菌菌株和A549细胞,将两者计数并在完全培养基中共培养20h,取培养上清液至96孔板按照试剂盒说明书将LDH显色,应用酶标仪测定上清液OD490nm评价各样品中LDH的相对浓度。3.实时荧光定量PCR应用总RNA提取试剂盒提取白念珠菌不同菌株的总RNA,过夜培养白念珠菌以获得对数生长期菌体并计数,用溶壁酶破除白念珠菌细胞壁,然后按照试剂盒说明书逐步提取,提取完毕后应用微量紫外分光光度计检测RNA浓度和纯度。应用反转录试剂盒按照说明书上的体系和程序去除各样品总RNA中的基因组DNA,避免白念珠菌基因组DNA干扰rt-PCR,然后以总RNA为模板进行反转录获得cDNA。应用rt-PCR试剂盒按照说明书以不同菌株cDNA为模板进行SYBR Green 1嵌合荧光法rt-PCR,实验结束后通过2-△△Ct方法分析获得相关基因在不同菌株中的相对表达量。4.PKA活性检测应用PKA活性检测试剂盒检测不同白念珠菌菌株中PKA的活性,该试剂盒使用发荧光的明亮的短肽作为底物,该底物对PKA具有高度特异性。实验中PKA将底物磷酸化,使其净电荷从+1变成-1,这种底物净电荷的变化可使磷酸化的底物与未磷酸化的底物在琼脂糖凝胶上迅速分开,最后以被磷酸化底物的荧光强弱评价不同样品PKA活性的大小。过夜培养白念珠菌以获得对数生长期菌体并计数,各菌株取1× 108菌体离心收集菌体,玻璃珠法破除白念珠菌细胞壁,按照试剂盒说明书制备PKA检测样品,设置实验组、PKA阳性对照组和PKA阴性对照组。将制备好的样品进行琼脂糖凝胶电泳分离磷酸化与未磷酸化的底物短肽,分离之后用凝胶成像系统拍照。结果1.白念珠菌spt20 △/△株诱导A549细胞内吞的能力下降为明确SPT20在白念珠菌诱导肺上皮细胞内吞的生物过程中是否起作用,应用上皮细胞内吞白念珠菌实验进行了探索。实验分为WT组、spt20△/△组和spt20△/SpT20组,分别与A549细胞共培养使白念珠菌与上皮细胞相互作用,共培养结束后显微镜下观察两者相互作用的结果。为标记白念珠菌并且区分白念珠菌对上皮细胞的黏附和侵入(被内吞),首先用耦合有FITC的抗白念珠菌抗体标记上皮细胞外的白念珠菌(显绿色),然后用Triton X-100通透上皮细胞,再用钙荧光白标记所有白念珠菌(显蓝色),显蓝色的菌体数减去显绿色的菌体数即为侵入上皮细胞的白念珠菌数。实验重复3次,每个细胞爬片至少计数100个白念株菌,结果发现sPt20△/△株被上皮细胞内吞数明显少于WT组,说明与WT相比,spt20△/△菌株诱导上皮细胞内吞被动侵袭上皮细胞的能力明显下降。2.白念珠菌spt20△/△株损伤A549细胞的能力下降为明确SPT20基因是否可以影响白念珠菌对A549细胞的损伤能力,应用白念珠菌损伤上皮细胞实验探索了白念珠菌缺失SPT20后对A549细胞损伤能力的变化情况。首先将WT、spt20△/△和spt20/SPT20三种菌株与A549细胞共培养,然后取培养上清液用试剂盒测乳酸脱氢酶(LDH)浓度差异用以表示其被损伤程度。实验重复3次,每次每个菌株测LDH浓度时重复3个孔,以最终测得的OD490表示共培养上清液中LDH的相对浓度,结果发现spt20△/△菌株与A549细胞共培养后上清液中LDH浓度最低,说明Spt20△/△菌株对A549细胞的损伤能力较WT株明显下降。3.白念珠菌spt20△/△株菌体PKA活性降低首先应用玻璃珠法破除白念珠菌各菌株的细胞壁制备样本,应用PKA活性检测试剂盒检测了 WT、spt20△/△和spt20△/SPT20三种菌株的PKA活性,从而探索SPT20存在与否对PKA的活性是否产生影响。实验证明,spt20△/△菌株的PKA活性较WT株和spt20△/SPT20株明显降低,说明白念珠菌缺失SPT20后菌体PKA活性降低，,SPT20可以影响菌体PKA活性。4.白念珠菌spt20△/△株△ALS3、RAS1基因表达量减少提取WT、spt20△/△和spt20△/SPT20三种菌株的总RNA,以总RNA为模板反转录得到各菌株cDNA,最后以cDNA为模板做实时荧光定量PCR检测三种菌株ALS3、RAS1基因的相对表达量,实验作3次生物重复,每次每个样本作3个技术重复,结果发现spt20△/△菌株ALS3、RAS1基因相对表达量较WT菌株和spt20△/SPT20株明显降低。结论白念珠菌SPT20可以调控RAS1基因表达,RAS1通过Ras1-cAMP-PKA通路调控PKA的活性,PKA可以影响转录因子Efg1发挥作用,转录因子Efgl调控侵袭素ALS3基因的转录表达,而侵袭素Als3蛋白介导了白念珠菌诱导宿主上皮细胞内吞被动侵袭上皮细胞的过程。综上得出本篇结论,SPT20通过Ras1-cAMP-PKA通路调控白念珠菌侵袭肺上皮细胞。