放射性肺损伤(Radiation-induced lung injury,RILI)是胸部肿瘤放疗常见的并发症,目前虽然进行了大量研究,但对RILI的发生机制和治疗干预等发病细节尚不清楚,使其早期诊断和针对性治疗难以展开。目前证据表明炎症在RILI的发生和发展尤其是急性RILI中起着核心作用,炎症细胞的局部募集和炎性细胞因子的产生在介导、放大和维持RILI过程中发挥重要作用。从分子生物学水平上讲,RILI的过程即为肺内多种效应细胞介导传递细胞间损伤信息,启动并维持多种细胞因子瀑布效应,从而造成损伤,最终引发肺纤维化。细胞外组蛋白是一种新近发现的一种内源性DAMP分子,介导感染和非感染性炎症反应,推测其可能作为重要的促炎介质参与RILI的发生发展。本课题首先研究小鼠RILI过程中血浆细胞外组蛋白水平动态变化规律以及与相关炎症因子和肺损伤相关指标的关系,然后在临床层面调查肺癌患者放射治疗后细胞外组蛋白的变化及其对细胞损伤及炎症反应的影响作用及干预。本研究证实了细胞外组蛋白在RILI过程中参与并发挥的重要作用,从而为防治RILI提供一有效靶点。本研究分为4个部分进行阐述。第一部分研究目的:建立小鼠RILI动物模型,并对其进行有效评价。研究方法:近交系雄性C57BL/6小鼠50只随机分为2组:对照组和照射组,每组每观察时间点均为5只,直线加速器12Gy照射后第1、3、5、8周处死,分别取对照组和照射组小鼠肺组织,釆用HE、VG染色法显微镜下观察肺组织病理学变化,并按照Szapiel分级法对肺泡炎的严重程度进行评估。研究结果:小鼠全胸经照射后,肺组织经过一系列病理变化。HE染色:小鼠照射后第1周,肺组织肺泡间隔略微增宽,毛细血管扩张充血;照射后第3周,肺组织肺泡间隔增宽,可见炎细胞浸润,血管扩张充血;照射后第5周和第8周,肺泡间隔增宽更加明显,部分肺泡腔塌陷,可见成纤维细胞和淋巴细胞等炎细胞浸润。VG染色后胶原纤维呈粉色。小鼠照射后第1周,肺组织肺泡间隔胶原纤维略微增多;照射后第3周,肺泡间隔增宽,胶原纤维数量增多;照射后第5周和第8周,肺泡间隔增宽更加明显,胶原纤维数量明显增多,部分肺泡腔塌陷。根据Szapiel分级法对小鼠肺组织肺泡炎程度进行量化评估。统计学分析显示:照射后第1周,照射组小鼠在形成肺泡炎的程度上与对照组差异无统计学意义(χ~2=0.625,P=0.444),但随着时间增加,照射组与对照组区别明显,肺泡炎程度加重,第3、5、8周差异均具有统计学意义(χ~2=13.868,P=0.001)。小结:直线加速器12Gy照射C57BL/6小鼠全胸,可成功构建RILI模型,为RILI的理论研究及防治靶点的筛选提供基础。第二部分研究目的:本部分研究血浆细胞外组蛋白在小鼠RILI过程中动态变化规律以及与相关炎症因子和肺损伤相关指标的关系,探讨细胞外组蛋白在RILI过程发挥的作用。研究方法:近交系雄性C57BL/6小鼠50只随机分为2组:对照组和照射组,每组每观察时间点均为5只,直线加速器12Gy照射后第1、3、5、8周处死,采用ELISA法检测各组肺组织匀浆液MPO活性及血浆细胞外组蛋白,采用高效液相芯片系统(Luminex)检测各组炎症因子(IL-1?、IL-6、TNF-α和TGF-?1)的动态变化,采用免疫组织化学技术检测各组肺组织TNF-α、TGF-?1和α-SMA蛋白表达水平。研究结果:小鼠照射后第1周肺组织匀浆液的MPO活性即开始出现表达增加,至第3周达到最高,第5周开始略有下降,但在第8周时仍高于基线水平,总体差异有统计学意义(F=69.006,P=0.000),进一步组间分析,第3、5、8周时间点间差异无统计学意义(P>0.05)。照射组小鼠各时间点细胞外组蛋白的变化规律为:照射后第1周即开始表达增加,至第3周达到最高,第5周开始略有下降,至第8周明显下降,但仍高于基线水平,各时间点间差异均有统计学意义(F=563.096,P=0.000)照射组各时间点IL-1?、IL-6、TGF-?1总体差异均有统计学意义(F=56.993、213.424、58.014,P=0.000),进一步组间比较,第1、5、8周时间点间差异均无统计学意义(P>0.05)。照射组各时间点间TNF-α差异均有统计学意义(F=505.622,P=0.000)。免疫组化结果因子显示:TNF-α、TGF-?1和α-SMA均呈棕黄色表达于细胞胞浆中。TNF-α、TGF-?1和α-SMA在对照组小鼠肺组织中表达极少。在照射后第3周时TNF-α及TGF-?1蛋白表达量最高,而α-SMA蛋白表达高峰在照射后第5周,照射后第8周纤维化启动后,炎症细胞浸润开始减少,血清细胞外组蛋白及相关炎症因子开始下降,TNF-α、TGF-?1及α-SMA蛋白表达量下降,但均仍高于基础水平。照射后不同时间点TNF-α、TGF-?1及α-SMA蛋白染色指数总体差异均有统计学意义(F=23.118、19.185、13.925,P=0.000),小结:小鼠全胸照射后,肺组织匀浆液MPO、血浆细胞外组蛋白及炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β1均出现不同程度的升高,变化规律相似;TNF-α、TGF-?1和α-SMA蛋白表达水平均出现不同程度的升高,与RILI形成的过程基本一致,提示细胞外组蛋白在RILI过程中发挥一定的促炎作用。第三部分研究目的:探讨肝素对RILI小鼠的保护作用。研究方法:将75只C57BL/6小鼠随机分为3组:对照组、单纯照射组和肝素处理组,每组每观察时间点均为5只。后2组采用直线加速器一次性12Gy剂量照射小鼠全胸,肝素处理组小鼠于照射后第2天开始每周皮下注射肝素300U/kg体质量,对照组和单纯照射组小鼠于相同时间给予一次性腹腔注射等体积质量分数为0.9%的氯化钠溶液或肝素300U/kg体质量。照射后第1、3、5、8周处死,分别取各组小鼠肺组织,釆用HE、VG染色法显微镜下观察肺组织病理学变化,按照Szapiel法对肺泡炎的严重程度进行评估。采用免疫组织化学技术检测各组肺组织TNF-α、TGF-?1和α-SMA蛋白表达水平。采用ELISA法检测血浆细胞外组蛋白,采用高效液相芯片系统(Luminex)检测各组炎症因子(IL-1?、IL-6、TNF-α和TGF-?1)的动态变化。研究结果:根据Szapiel分级法对3组小鼠肺泡炎程度进行量化评估。统计学分析显示:照射后第1周,3组间小鼠肺泡炎程度差异无统计学意义(χ~2=3.278,P=0.194),但随着时间增加(第3、5、8周),与单纯照射组比较,肝素处理组小鼠肺泡炎的程度减轻,但仍明显高于对照组,差异均具有统计学意义(χ~2=22.373、19.579、19.498,P=0.000、0.000、0.001)。与单纯照射组比较,肝素处理后减少了小鼠肺泡壁的厚度及间质水肿,减弱了胶原沉积。除第1周外,剩余时间点(第3、5、8周)肝素处理组TNF-α、TGF-?1及α-SMA蛋白染色指数均较单纯对照组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。肝素处理组在研究的各观察时间点细胞外组蛋白及炎症因子水平均显示出下降的趋势,但均仍高于基线水平,差异均有统计学意义(P<0.05)小结:应用肝素对早期RILI有一定的防治效果,其防治作用可能通过以下途径实现:中和细胞外组蛋白,下调小鼠血浆促炎细胞因子,降低肺组织TNF-α、TGF-?1及α-SMA的表达,不同程度上抑制或减轻肺泡的炎性反应,从而为RILI防治提供新的治理策略。第四部分研究目的:调查肺癌患者放射治疗后细胞外组蛋白的变化及其对全身炎症的影响。研究方法:从45名不能手术肺癌患者5个时间点(放疗前1天,放疗后第1天,第1、3、5周)获得血液样品,测量细胞外组蛋白、MPO和多种炎性细胞因子。此外,将患者放疗后的血清与人肺上皮细胞系(BEAS-2B)和人单核细胞系(U937)孵育过夜,同时给予特异性抗组蛋白中和抗体进行干预,评估细胞损伤程度和细胞因子生成等指标。研究结果:与放疗前相比,放疗后第1周时细胞外组蛋白水平显著增加,至第3周时达到高峰,并伴随着MPO和炎性细胞因子的升高,至第5周时细胞外组蛋白开始下降,炎性细胞因子亦开始降低,但仍高于放疗前水平,差异均有统计学意义(P<0.05)。细胞外组蛋白的动态变化与这些炎症标记物密切相关。与放疗前获得的血清相比,患者放疗后血清能显著引起BEAS-2B细胞损伤和刺激U937细胞上清液中的细胞因子产生,特异性抗组蛋白中和抗体能明显抑制这一损伤效应。小结:本研究揭示了细胞外组蛋白可能是导致放疗后炎症反应的主要原因,细胞外组蛋白一方面可作为特异性生物标志物预测RILI的发生发展,另一方面可作为干预靶点治疗放射性肺损伤。全文结论:1.直线加速器12Gy照射C57BL/6小鼠全胸,可以成功构建RILI模型。2.小鼠全胸照射后,肺组织匀浆液MPO、血浆细胞外组蛋白及炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β1均出现不同程度的升高,TNF-α、TGF-?1和α-SMA蛋白表达水平均出现不同程度的升高,与RILI形成的过程基本一致,表明细胞外组蛋白在RILI发病过程中发挥促炎作用。3.应用肝素中和细胞外组蛋白,能下调小鼠血浆促炎细胞因子,降低肺组织TNF-α、TGF-?1及α-SMA的表达,不同程度上抑制或减轻肺泡的炎性反应,对早期RILI有一定的防治效果。4.细胞外组蛋白可作为放疗相关系统性炎症的标志物,并可能是重要的治疗靶点。