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本研究通过分离孵化5.5 d的鸡胚胎性腺中的原始生殖细胞(Primordial Germ Cells,PGCs),建立体外培养体系,研究PGCs生物学特性及定向诱导精子发生,探讨鸡PGCs体外发育潜能;分离培养6周龄胎羊肾间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs),研究其生物学特性,并在体外诱导其减数分裂,为体外诱导干细胞精子发生提供理论依据。研究表明:1分离鸡胚性腺组织,经0.125%胰酶消化,以添加了10%胎牛血清、2%鸡血清、1 mM丙酮酸钠、2 mM L-谷氨酰胺、55μMβ巯基乙醇、10 ng/mL hSCF、10 units/mL LIF、20 ng/mL bFGF和10 ng/mL IGF的H-DMEM培养液进行原代培养。培养24 h后可见部分PGCs粘附在性腺原基细胞上生长,48 h后PGCs克隆团明显增大增多,3 d后接种到经10μg/mL丝裂霉素C处理过的鸡成纤维细胞饲养层上培养。通过对比原代PGCs与性腺原基细胞共培养和在饲养层细胞上培养两种方法,结果发现,原代PGCs与共同来源的性腺原基细胞共培养能显著提高PGCs克隆团形成率。2本研究的培养体系中,PGCs可培养至第6代,其形态学上比周围细胞大且胞质饱满,折光率高;经PAS和AKP染色鉴定为阳性;RT-PCR鉴定克隆团细胞表达CVH、BLIMP1、POUV和NANOG基因;免疫荧光鉴定克隆团细胞表达SSEA-1、SSEA-3、BLIMP1、OCT4和SOX2。3 PGCs经1μM维甲酸(Retinoic acid,RA)诱导24 h后可见精子样细胞出现,RT-PCR鉴定诱导后的细胞表达减数分裂和单倍体细胞特异基因SYCP1、BOULE、DAZL、STRA8、DMC1和ACR。结合干细胞因子共同诱导PGCs精子发生,可显著提高SYCP1、BOULE和DMC1基因的表达量,提高单倍体细胞的诱导率。4分离肾组织,经0.25%胰酶消化后,以添加10%胎牛血清的DMEM/F12进行原代培养。24 h后换液去除未贴壁的细胞。细胞生长至80%覆盖皿底进行传代,传3~4代后细胞可达到较高纯度,经流式分析细胞纯度达到95%以上。经RT-PCR和免疫荧光鉴定细胞表达OCT4、CD44、VIM、PAX2和FN1。生长曲线分析MSCs的生长经历潜伏期、对数生长期、稳定期和衰退期,呈典型的S形。克隆形成能力结果显示P4代细胞克隆形成率为56.33%±2.52%,P10代为34.33%±3.06%,P16代为19.67%±2.08%。核型分析结果表明体外培养的羊肾MSCs染色体数目为2n=54条,95%以上的细胞核型均正常。5在体外对MSCs展开了多向分化潜能的研究,在相应的诱导条件下,成功将MSCs诱导成脂肪样细胞、肝样细胞和软骨样细胞,经特异性染色和RT-PCR鉴定诱导形成了目的细胞。6 RA与睾丸提取液都能诱导MSCs进入减数分裂阶段,通过RT-PCR检测细胞表达DAZL、PRM1、TNP1、TNP2、DDX4、MLH1和SCYP3,免疫荧光鉴定细胞表达减数分裂和单倍体细胞特异标记物DAZL、C-KIT、CTDSPL和ACR。睾丸提取液结合RA共同诱导能够显著提升单倍体细胞的诱导效率。