研究背景：甲状腺功能减退(hypothyroidism,简称甲减)是由于甲状腺激素合成及分泌减少,或其生理效应不足所致机体代谢降低的一种疾病。按照疾病的严重程度,甲状腺功能减退可分为亚临床甲状腺功能减退(subclinical hypothyroidism,简称亚甲减)和临床甲状腺功能减退(overt hypothyroidism,简称临床甲减)。亚甲减是指血清甲状腺激素水平正常,促甲状腺激素(thyrotropin, TSH)水平超出正常值上限；而临床甲减是指是血清甲状腺激素水平降低的同时伴有TSH水平升高。近年来,世界范围内甲减的患病率显著上升。有研究表明,甲减与导致心血管疾病的多种危险因素密切相关,是冠心病发生发展的独立危险因素,是继发性高血压和血脂异常的重要原因。因此,揭示甲减的病因,对疾病做到早期预防就显得尤为重要。研究显示,自身免疫反应、碘摄入过多或不足、炎症等多种因素均可引起甲状腺激素合成障碍,从而导致甲减。然而,这些原因尚难以完全解释减高发的现象。作为膳食的三大营养素之一,膳食脂肪是人类饮食的重要组成成分,在供给热量、提供人体必需脂肪酸和脂溶性维生素、保护隔离等方面发挥着不可替代的作用。然而,过量的膳食脂肪摄入可使血中的甘油三酯及其水解产物游离脂肪酸增多,超出机体对游离脂肪酸的处理能力及脂肪组织对甘油三酯及游离脂肪酸的储存能力,导致大量甘油三酯和游离脂肪酸在非脂肪组织异位沉积,继而造成组织细胞的慢性损伤,最终引起靶器官的功能障碍,这种现象被称为脂毒性(Lipotoxicity)。脂毒性与疾病的关系已引起国内外广泛关注,特别是脂毒性在糖尿病、脂肪肝、代谢综合征等代谢性疾病的发病机制中的研究尤为突出,干预脂毒性已成为防治上述疾病的重要策略。甲状腺是人体重要的内分泌器官,主要功能是合成甲状腺激素,调节机体物质及能量代谢。甲状腺激素有四碘甲腺原氨酸(thyroxine,3,5,3’,5’-tetraiodotyyronine,T4)和三碘甲腺原氨酸(3,5,3’-triiodothyronine, T3)两种,这两种激素的体内平衡对多种器官的发育具有重要作用,对人体的各种代谢及维持人体细胞的生命活动有着至关重要的作用。甲状腺激素的合成和分泌受下丘脑分泌的促甲状腺激素释放激素(TRH)和腺垂体分泌的促甲状腺激素(TSH)的调节。生理情况下,下丘脑释放TRH促进腺垂体TSH的分泌,TSH进一步作用于甲状腺滤泡上皮细胞上的TSHR促进T4和T3的合成和分泌；当血液中甲状腺激素浓度升高后,可负反馈抑制腺垂体TSH的合成和释放,从而保证血液中甲状腺激素水平不至于过高；而当血中甲状腺激素浓度降低时,对腺垂体的抑制作用减弱,TSH分泌增加,从而升高血液中甲状腺激素水平。甲状腺激素的合成主要是在甲状腺细胞钠碘转运体(Sodium iodide symporter, NIS)、甲状腺球蛋白(Thyroglobulin, Tg)、甲状腺过氧化物酶(Thyroid peroxidase, TPO)等分子的参与下共同完成的。既往有限的体内研究提示过量膳食脂肪摄入可使血清甲状腺激素和(或)TSH水平发生改变。Araujo RL的研究发现添加了猪油和豆油的混合高脂饲料喂养8周的大鼠血清TSH水平显著升高,而T4和T3水平无明显改变。Han等在研究高碘和高脂摄入同时作用对甲状腺的影响时也发现,给予小鼠添加了猪油和胆固醇的高脂饲料分别喂养1,3和6个月,小鼠血清甘油三酯水平升高的同时,T4和T3水平也时间依赖性下降。不同的高脂成分及不同的高脂摄入时间可能导致了以上研究结果的不一致性。本研究中,我们分别通过体内(高脂喂养大鼠模型)与体外细胞水平(棕榈酸刺激甲状腺细胞)研究,不仅动态观察大鼠血清甲状腺激素水平变化,从甲状腺形态结构(分别从大体、显微及超微水平)及甲状腺激素合成相关分子表达方面阐明高脂摄入对甲状腺的影响,而且识别其关键分子,为血脂异常伴甲状腺功能异常提供新的治疗思路和策略。目的：1、动态观察长期高脂饮食对大鼠血清甲状腺激素水平、甲状腺形态结构(分别从大体、显微及超微水平)及甲状腺激素合成相关分子表达的影响,明确脂毒性对甲状腺功能是否存在影响。2、通过棕榈酸下调甲状腺细胞Tg、NISTPO的表达水平及功能,初步揭示脂毒性影响甲状腺功能的作用机制。研究方法：1、动物分组与造模：雄性SD大鼠40只(170-190g,6周龄),适应性饲养一周后,随机分为2组,每组20只,即普通饮食组和高脂饮食组,分别给予普通饮食(100%基础饲料,3.49kcal/g)或高脂饮食(85%基础饲料+15%猪油,4.14 kcal/g)喂养24周。喂养过程中分别于第12、18周经锁骨下静脉穿刺取空腹血,24周处死时留取空腹血和甲状腺组织。2、人甲状腺原代细胞培养：人甲状腺组织剪碎,Ⅰ型胶原酶与胰酶混合液中37℃消化40-60 min,过滤后洗涤沉淀并种板,使用含NBS及TSH的DMEM/F12培养基培养。3、血脂谱的评估：使用全自动生化分析仪测定高脂喂养24周大鼠血清总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)。4、循环甲状腺激素水平的评估：应用ELISA检测高脂喂养12、18及24周时大鼠血清TT4、FT4及TSH水平变化。5、甲状腺形态结构影响的评估：分别采用高频超声扫描、HE染色及透射电镜观察高脂喂养24周大鼠甲状腺组织及超微结构的变化,并超声下测量甲状腺体积。6、组织细胞内脂质含量的评估：应用酶法测定甲状腺组织和细胞内甘油三酯及游离脂肪酸含量。7、甲状腺激素合成相关分子mRNA水平表达的评估：采用Real time-PCR检测大鼠甲状腺内甲状腺激素合成相关分子NIS、Tg、TPO、Deiodinase 1、TSHR、Pendrin和 DUOX2在mRNA水平变化,检测人甲状腺原代细胞内NIS、Tg、TP O在mRNA水平变化。8、甲状腺激素合成相关分子蛋白水平表达的评估：采用Western Blotting、免疫组化和免疫荧光的方法检测NIS、Tg、TPO在甲状腺组织及体外培养细胞蛋白水平的变化。9、Tg、NIS、TPO功能的评估：用细胞上清中分泌的Tg含量、摄碘率及TPO活性测定来对Tg、NIS、TPO功能进行测定。10、采用SPSS 18.0软件分析实验数据。定量数据用均数±标准差(x±s)表示,组间均数的比较采用方差齐性检验与t检验和单因素方差分析,相关性采用Pearson相关分析。P<0.05作为差异显著性界值。结果：1、长期高脂饮食增加大鼠体重,升高血脂造模起始时两组大鼠的体重无明显差别。不同饮食喂养24周后,高脂饮食组大鼠的体重比普通饮食组显著增加(P<0.05),高脂饮食组大鼠的血清甘油三酯较普通饮食组升高了79%(P=0.002)。血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇两组间的差别无统计学意义。2、长期高脂饮食降低血清TT4、FT4,升高血清TSH造模12周时,普通饮食组和高脂饮食组大鼠的血清TT4、FT4无显著差异(P>0.05)。然而,随着造模时间的延长,喂养18周及24周时高脂饮食组大鼠的血清TT4和FT4较普通饮食组显著下降。在不同饮食喂养12、18及24周时,高脂饮食组大鼠的血清TSH均较普通饮食组显著升高(P均<0.05)。3、大鼠血清甘油三酯水平和TT4水平呈负相关对两组大鼠的血清甘油三酯水平和TT4水平进行Pearson相关分析,结果显示二者呈负相关(r=-0.35：P=0.027)。该结果表明血清甘油三酯水平和甲状腺功能呈浓度依赖性负相关。4、长期高脂饮食增加大鼠甲状腺内甘油三酯含量高脂饮食组大鼠甲状腺内的甘油三酯含量较普通饮食组升高了2.4倍(P=0.032)。这表明在血清甘油三酯水平升高的同时,甲状腺沉积的甘油三酯同时增加。5、长期高脂饮食引起大鼠甲状腺的超声形态学改变普通饮食组大鼠甲状腺实质回声均匀,而与之相比,高脂饮食组大鼠甲状腺回声减低且不均,且由头尾径、前后径及中间外侧径计算所得的甲状腺左、右体积分别增大44.5%(P<0.01)和49.0%(P<0.05),甲状腺总体积增大46.6%(P<0.01)。6、长期高脂饮食引起大鼠甲状腺的组织形态学及超微结构改变HE染色结果显示：光镜下普通饮食组大鼠甲状腺滤泡大小均匀,形态规则,滤泡中胶质含量正常,染色呈粉红色,滤泡上皮细胞呈立方或柱状,排列紧密。而高脂饮食组大鼠甲状腺呈现不同程度的局域性滤泡腔增大,滤泡形态不规则,胶质增多,滤泡上皮细胞变扁平。透射电镜下观察：普通饮食组大鼠的甲状腺滤泡上皮细胞的顶端膜上微绒毛紧密排列,细胞核和内质网形态正常,顶端膜区分泌小泡和胶质颗粒丰富。与之相对比,高脂饮食组大鼠甲状腺滤泡上皮细胞的顶端膜上微绒毛稀疏,细胞核扭曲变形,核周池增宽,内质网肿胀扩张,分泌小泡较少。7、长期高脂饮食降低甲状腺内NIS的表达Real-time PCR检测显示,与甲状腺激素合成相关的分子中,高脂饮食组大鼠甲状腺内NIS的转录水平与普通饮食组相比有所下降。免疫组化结果验证,大鼠甲状腺内NIS的蛋白水平与转录水平结果一致。8、棕榈酸处理增加甲状腺细胞内脂质含量活细胞示踪结果显示,随时间延长,甲状腺细胞棕榈酸分布增加。细胞内甘油三酯和游离脂肪酸含量随棕榈酸处理浓度的增加和时间的延长而增加。9、棕榈酸处理下调甲状腺细胞内Tg、NIS和TPO的表达及功能人甲状腺原代细胞中Tg.NIS和TPO无论是mRNA水平还是蛋白水平均随PA处理浓度的增加及处理时间的延长而逐渐下降。且PA 0.4 mM处理显著减少细胞上清中Tg的分泌量,降低细胞的摄碘能力,并下调甲状腺细胞内TPO活性。结论：1.长期高脂饮食在升高大鼠血清甘油三酯水平的同时,可增加其甲状腺内甘油三酯含量。同时,棕榈酸处理也可增加体外培养甲状腺细胞内脂质含量。这为脂毒性影响甲状腺功能提供了前提基础。2.长期高脂饮食降低血清TT4和FT4水平,升高血清TSH水平,改变甲状腺的形态结构,并伴随着NIS表达的下降。棕榈酸处理下调甲状腺激素合成关键分子Tg、NIS和TPO的表达,并降低其功能。这为脂毒性影响甲状腺提供了事实依据。