背景/目的:骨关节炎(OA)是最常见的慢性关节疾病。在美国,约有两千七百万人受到OA的困扰。在60岁以上的老年人群中,约有10%的男性及18%的女性受到骨关节炎的困扰。有报道指出,在发达国家,骨关节炎的治疗及其相关费用可高达GDP1%到2.5%。虽然众多学者对骨关节炎的发生及发展机制提出了诸多的假说,但骨关节炎的分子生物学机制仍然大部分未知。上皮生长因子受体(EGFR)通路对于组织的代谢非常重要。诸如上皮生长因子(EGF)等多个的配体,可以激活EGFR通路。一旦激活EGFR通路,它可以刺激细胞内信号传导显著的调节细胞的行为。人们目前对于EGFR通路的了解多来自于其配体和细胞内抑制剂Mig-6的了解。基因芯片分析发现TGFα和HB-EGF的表达在OA手术模型啮齿类动物以及OA患者的软骨细胞中明显升高。在我们以前的研究中发现,EGFR基因软骨特异性敲除的小鼠具有软骨表面的缺陷,并可自发的发生软骨的退变。同时,在生长板的发育过程中,EGFR也起到了重要的调节作用。同时,在预实验阶段,我们在OA患者关节软骨及小鼠OA模型的关节软骨中发现EGFR通路的活性与OA的进展程度存在一定的负相关性。由以上研究,我们认为EGFR在生理及病理条件下对于软骨具有重要的调节作用。为了充分、全面的了解EGFR通路在OA过程中的作用,我们首先研究了 EGFR通路在正常关节软骨中的作用,并将这一部分作为本次研究的第一部分,也是后续部分的研究基础。年老患者的骨关节炎的最为常见的特征是关节软骨的退变。成熟的关节软骨由表层、移行层、辐射层和钙化层构成。其中,关节软骨表层由于位于软骨的最表面,具有特殊的功能和独特的构成,成为预防OA发生最为重要的一层。表层软骨由2-4层扁平细胞构成,可分泌蛋白多糖4(Prg4,Iubricin),固生蛋白C(tenascin C)物质等。其胶原纤维的分布是与关节面表层相平行的。表层细胞中具有软骨祖细胞,并具有分泌润滑蛋白,抵抗剪切应力等作用。在骨关节炎发生后,软骨细胞组织紊乱,韧性加大,软骨表层变得不规则。虽然软骨表层细胞在维持正常的细胞软骨,预防OA具有重要的作用,但是人们对于调控它的生长因子和激素的了解仍然十分匮乏。在前期的预实验阶段,我们发现EGFR的活性和病人骨关节炎的严重程度呈负相关。这再次提示,在EGFR在OA的发生及进展过程中起到了重要的作用,EGFR的作用可能是通过保护软骨表层细胞实现的。故,在本次研究的第二部分,使用EGFR软骨特异性敲除的小鼠,通过DMM手术建立OA模型,研究EGFR在骨关节炎中的作用。目前,研究人员在研发的治疗药物时多聚焦于如何预防关节软骨的退变,及如何修复退变的软骨。然而在过去几十年的临床观和动物模型的研究中发现,OA是一个影响整个关节的疾病,而不仅仅影响关节软骨,其相近的组织结构,例如软骨下骨,韧带,半月板,相近的肌肉,神经,滑膜等同样受到影响。软骨下骨的硬化是OA晚期典型的症状之一。有学者指出软骨下骨的硬化可加速其上方关节软骨的退变,学者认为软骨下骨的变化,例如在核磁共振中常见的骨髓损伤(BML),出现在关节软骨的退变之前并可以作为OA发生的预测性指标之一。虽然,以上观点存在争议,但至少可以提示我们,在本次研究中,我们不应仅仅聚焦于在OA的过程中软骨的变化,对于其下方的软骨下骨区域变化的研究具有同样重要的意义。我第二部分的研究中,同样观察到,在OA的晚期,骨赘形成,软骨下骨明显硬化。除了在软骨角度的阐述,在骨的角度,进一步研究OA晚期软骨下骨的变化机制及其对于关节软骨的影响是文章研究EGFR通路在OA中作用的拓展和延伸。为了排除我们观察到的变化仅仅局限在EGFR软骨特异性敲除的小鼠,我们在野生型(WT)小鼠上进行了进一步的实验,观察到了同样的现象,验证了我们的假说。从解剖学上来讲,软骨下骨有一层类似于皮质骨的软骨下骨板(SBP)及其下方的软骨下骨松质(STB)构成。在OA的研究中,区分这两者具有重要的意义,一方面由于这两者在结构和机械力学上具有明显区别,另一方面,在晚期OA中,其病理特征具有明显的不同。因为具有较大的体积,研究人员多用OA患者或者非啮齿类动物进行软骨下骨的研究。其增厚的SBP是OA非常明显的特征。然而,其细胞分子机制却不明确。在OA的发展过程中,STB的改建明显增加,导致其结构发生减退。目前有,诸如微损伤结构细胞通路,血管生成,骨软骨通过SBP交互作用等机制试图解释这个现象。为了明确这个细胞分子机制,在转基因鼠中分别研究SBP和STB的表型具有重要意义。此部分机制研究,作为本次研究的最后的部分。然而,很多学者在研究使用显微CT检测OA小鼠模型的SBP的变化时,大部分使用胫骨作为研究目标,同时CT的分辨率太低(10-20 μm),不足以进行3D的研究。另外,其研究方式也多是在纵向切面中使用2D的方式,这种方法难以全面分析SBP的变化。用这些方法分析的结果,因长骨角度及选取部位的不同具有较大的差异。因此,急需设计一种基于3D的方法来准确研究小鼠SBP和STB的变化。这是准确进行研究晚期OA中SBP硬化的作用机制的基础。所以,一种3D分析方法的探讨作为本次研究的第三部分。另外,我们以本次研究为依托,进行了以EGFR通路为靶点的药物研究。我们合成了一种Fn3-Fc-TGFα结合蛋白,可特异性的结合软骨细胞,并增加EGFR通路的活性。从前期的预实验看来具有一定的前景。但仍然需要进行进一步的测试和研究,距离真正的临床实践尚有较大距离。希望通过未来的研究,可以不断改进和完善此种药物,有朝一日,可以服务于OA患者。方法:第-部分:为了研究EGFR通路在软骨中的表达,我们利用qRT-PCR检测了 EGFR家族及其相关配体在小鼠股骨头软骨细胞中的表达。在细胞实验中,使用EGFR通路的激活剂TGFa及抑制剂gefitinib,比较各组之间表层软骨细胞的形态变化,及其增殖,分化,抗凋亡的能力。通过牛关节软骨的体外培养比较使用EGFR通路的激活剂TGFa及抑制剂gefitinib后表面润滑物质Prg4和透明质酸(HA)的表达量。通过摩擦实验,进一步说明EGFR调节表面润滑物质的量。第二部分:在之前的EGFR通路在生长板发育和第二骨化中心形成的研究中,我们建立了一个EGFR软骨特异性敲除的小鼠模型(CoI2-Cre EGFRwa5/flox)。在此次的研究中,我们使用此模型研究EGFR在关节软骨发育中的作用。首先,我们比较了 WT和CKO小鼠之间,软骨细胞形态及数量,胶原纤维的组织结构,表面润滑物质等差异。其次,我们使用手术建立内侧半月板的不稳定(DMM)的OA小鼠模型,来研究EGFR在OA中的作用。第三部分:因为常见的软骨下骨的分析方法无法满足我们对于SBP的准确研究。我们建立了一个基于显微CT的分析股骨髁SBP的3D的方法。第四部分:最近我们利用了四个晚期OA的模型,包括EGFR软骨特异性敲除的小鼠模型(CoI2-Cre EgfrWa5/fIox)及其他WT晚期OA的模型,利用第三部分的分析方法,比较SBP硬化的位置及程度,同时研究硬化的SBP周围成骨细胞,硬化蛋白的变化,并进一步通过电脑模拟有限元分析的方法,阐述应力所起到的作用。从而明确其变化的机制。在讨论部分,结合本部分研究及以往的实验经验,讨论在OA的过程中软骨下骨变化对于软骨的影响。结果EGFR通路在健康及病态关节软骨中的表达qRT-PCR检测了在小鼠股骨头软骨细胞中EGFR家族及其相关配体的表达。结果显示,其中 Tgfα、Hbegf、amphiregulin、epiregulin 相对较高,Egf 和betacellulin表达相对较低。关节软骨的组织学检测发现EGFR染色在所有的软骨组织中均为阳性。而作为EGFR活性的指标p-EGFR,大部分位于软骨细胞表面,仅有少数位于钙化的软骨中。通过DMM手术建立OA模型,可在小鼠中诱导产生类似于OA的表型。手术后一个月,关节软骨中还未出现明显的形态学变化,此时,EGFR的染色在整个软骨中可见,但是P-EGFR的染色在关节软骨表面却已经消失。在健康的人软骨中,整个软骨可见非常强的EGFR染色,然而p-EGFR的染色仅位于软骨表层。在OA发生的早期,关节表层依旧完整,但蛋白多糖的的染色却部分消失,p-EGFR的染色明显减少。以上现象显示,EGFR通路在健康及病态软骨表层可能具有重要的作用。软骨细胞中EGFR通路缺陷导致关节软骨发育异常我们原代培养来自于EGFR软骨特异性敲除的老鼠(CKO,Col2-Cre EgfrWa5/flox)及其同笼其他小鼠的软骨细胞,发现EGFR通路的活性WT>Wa5>>CKO。CKO小鼠因为Wa5基因的存在,在其关节软骨中仍可见EGFR的表达,但是p-EGFR和p-ERK的量却相对于WT明显下降。与细胞培养结果相一致的是,在Wa5小鼠中,p-EGFR和p-ERK的染色与WT较为接近。在小鼠两个月大时,与WT和Wa5小鼠相比EgfrCKO来说,关节软骨厚度减少,虽然变化量较小但是具有统计学差异。在6个月大时,CKO小鼠的软骨细胞减少变得更为明显,同时Wa5小鼠也逐渐显示出相同的软骨细胞数目减少的趋势。CKO小鼠的软骨减少伴随着钙化和非钙化层的减少,以及形态上肥大细胞的比例增高。CKO小鼠可见类似于早期OA样的变化,例如软骨在Safranin O染色中染色较少,同时在软骨表面可见小的裂痕。Mankin打分在6.8±0.6。EGFR是维持软骨细胞表层所必须的虽然在小鼠2周大的时候,关节软骨表层的结构正常,但是Wa5以及CKO中的细胞数量却相对于WT减少了 56.6%及88.5%。同样的,在其他的非钙化层,也观察到了这种减少,只是相对于软骨表层,并没有那么明显。CKO中的表层细胞Ki67的染色较少,而TUNEL的染色较多。同时,在软骨深层可见CoIX的染色阳性,这说明EGFR通路对于维持软骨表层及肥大细胞的增殖和细胞存活具有重要作用。通过TGFα激活EGFR可以在细胞实验中,促进表层软骨细胞的增殖,增加对于血清饥饿造成的凋亡的抵抗力。在成软骨分化实验中,经过TGFα处理的细胞可以保持扁平的细胞形态,并维持蛋白多糖在较低水平,而对照组中,细胞呈多边形,在alcian blue实验中可见更多的蛋白多糖聚集。在TGFa组中同时使用EGFR抑制剂gefitinib可以使其作用消失。TGFa可以减少Col2和aggrecan这两种软骨外基质基因的表达。以上数据显示,EGFR通路在保持表层细胞活性方面具有重要作用,其可以维持细胞的存活并减少软骨外基质的产生。EGFR通路促进关节软骨的润滑作用在WT中,在关节软骨及半月板表面可见Prg4和HA分布。而在CKO中,它们却几乎消失。而作为对照,它们在滑膜中的量几乎没有变化。这些现象与我们在CKO中观察到的p-EGFR的染色结果是相一致的。我们同样观察到了 EGFR活性在半月板中下降,但是在滑膜中没有变化。在软骨细胞原代细胞培养中,显示随着时间的变化,TGFa可以增加Prg4的表达。这种上调作用可以被gefinitib完全废除。牛软骨最表层1 mm的软骨进行组织培养,我们发现了 TGFa可以通过EGFR通路在mRNA及蛋白水平上上调Prg4.说明EGFR可以独立上调关节软骨Prg4。在摩擦实验中,我们发现经过TGFα 3天处理后,其表面摩擦系数减少了28%。从而说明EGFR对于维持软骨的润滑具有重要的作用。EGFR通路缺乏导致关节软骨减弱在偏光显微镜下,我们观察到WT的胶原组织在软骨表层主要是呈横向分布,而在深层呈现纵向分布。然而在CKO中,在中层及钙化层胶原纤维的结构改变,导致出现其方向呈现随机的分布,组织结构紊乱。这种胶原的网络机构与OA中的变化非常的相近,在DMM术后2个月的WT中,我们可见中层软骨退变,同时其胶原结的构和方向紊乱。我们利用原子压痕技术,分析了小鼠关节软骨的机械特性。与我们在偏光显微镜中所观察到的一样,我们在Wa5及CKO中检测到其软骨有效压痕弹性模量(Eind)相对于WT而言,分别下降了 58.7%和74.7%。这些数据与我们观察到的DMM手术可以快速降低其小鼠的Eind相一致。综上所述,我们的数据显示EGFR通路可以调节关节软骨的机械学特性。在软骨细胞中EGFR缺乏可明显导致DMM术后软骨的损伤因为CKO小鼠的软骨具有机构、功能、及力学特性缺陷,其应该更易于在关节不稳定之后导致OA的发生。在术后一个月,WT小鼠的关节软骨保持完整,但是CKO小鼠却出现如软骨表而裂痕、缺损等关节损伤,同时钙化及非钙化层明显减少。术后两个月,CKO小鼠出现在关节的内侧出现严重的磨损,可导致Mankin score满分。术后3个月,CKO小鼠几乎丢失了包括钙化及非钙化层在内的的所有的关节软骨。与我们之前报道的一样,Wa5在DMM术后,与WT相比显示出OA发展的轻度加速,但是与CKO相比,症状明显轻得多。与关节软骨的表型相一致,CKO小鼠表现出严重的晚期OA的表型。首先,当WT的关节外侧仍保持完整时,CKO可见由内侧向外侧的OA表型。第二,我们发现了在软骨下骨的增厚硬化出现在关节软骨的损伤的部位。第三,在CKO小鼠的DMM手术部位,Eind相比较WT的,增加了 4.3倍,甚至比WT的非手术侧更多,提示,在CKO的手术侧,关节表面可能是钙化的软骨或者是软骨下骨。而值得注意的是,在WT中,DMM侧软骨的Eind比较于非手术侧降低67.2%。在OA的发展过程中,WT的手术侧相较于对侧同样显示出Eind增加。第四,关节疼痛同样是OA的主要症状之一。为了检测疼痛程度,我们使用了 Frey实验,我们发现CKODMM侧对于疼痛的刺激较敏感,相对于WTDMM而言,其疼痛阈值只有29.7%。最后,我们统计了关节中骨赘的数量,我们未在16只WT及9只Wa5的手术及非手术侧发现骨赘,而在18只CKO中,6个sham侧具有骨赘,在DMM侧有8个有骨赘,骨赘起始于股骨或者胫骨的生长板。综上,我们发现CKO小鼠在DMM术后两个月产生OA晚期的表型,这比WT小鼠要快得多。另外,在干骺端的松质骨中,无论是WT,Wa5还是CKO,无论是否做DMM手术,我们均未发现差异。血清中成骨(osteocalcin)及破骨(CTX)指标同样未见差异。这说明CKO本身并没有对骨本身造成影响。软骨下骨的分析应在股骨远端应用microCT 3D重建技发现,小鼠的软骨下骨区域在股骨远端,比胫骨近端既大又高。平均来说,胫骨平台的STB高度在180um。适合分析的范围在2/6至5/6之间。超过这个范围,SBP区域内侧或者外侧与生长板融合难以分析。如果按照μCT的分辨率为6um计算,总共大约有30个切面可以进行分析。如果在冠状面或者矢状面进行分析,虽然有更多的截面可用于分析,但是由于其范围有限,在画图分析的过程中,SBP与 STB难以准确区分。SBP在OA晚期的硬化使得在胫骨近端准确定义SBP区域变得更加的困难,甚至不可能。而相反的是,在股骨,大约有600um的高度可以分析。所以无论在任何角度,在股骨界定STB可以更加的准确。小鼠与人的膝关节不同的地方在于人的膝关节是可以完全伸直的,而小鼠的膝关节只能在伸直时的30度,到弯曲时的150度之间活动,从而小鼠的股骨髁与胫骨平台相接触的部位是股骨髁的后部。同时,这也是在运动中机械力学传导通过的部位。有意思的是矢状面的图像显示股骨髁的内外两侧的SBP后方的厚度要大于前侧。为了使用3D的方法有效的分析指定位置的SBP厚度,我们建立一套方法将SBP的厚度转化成不同颜色,通过颜色来对应不同的厚度。使用这种方法,我们先人工的选定我们感兴趣的SBP区域,并计算其平均厚度。分析结果证实,在4月大的WT中双侧的股骨髁后方的SBP厚度,约为前方厚度的一倍。这说明SBP的厚度与应力的强度是正相关的。因为在胫骨SBP与生长板的距离太近,无法准确适用这个方法界定SBP的范围。基于以上因素,我们在本次研究中使用股骨髁而非胫骨近端来进行SBP的研究。EGFR软骨特异性敲除的小鼠(CKO)的SBP在DMM手术侧的关节内侧增厚CKO小鼠在DMM术后两个月,可见关节内侧的软骨完全消失等严重OA的表型。用显微CT进行股骨髁STB的研究发现在CKO中BV/TV轻度减少,但有统计学差异。同时伴随骨小梁厚度的减少。而在WT中无明显变化。2D的冠状面图像显示CKO小鼠在股骨的内侧(DMM的部位)产生最为严重的关节软骨损伤。此部位的SBP相比较于股骨的外侧,以及假手术侧的双侧明显增厚。使用我们的SBP分析的方法,我们计算了股骨髁不同部位(内前,内后,外前,外后侧)的SBP厚度,得知,DMM侧的股骨髁后内侧SBP相对于非手术侧增加31%,而其他部位手术与非手术侧无明显变化。表明,这种局限的SBP的增厚可能是其上方的软骨的损伤所导致。在偏光显微镜中可见CKO相比较与WT有更多的延迟,说明在OA的晚期,胶原的组成和形态可能发生了变化。我们之前报道了,由于在Wa5的小鼠中,EGFR的活性只是轻度的减弱,而在CKO中显著的降低,所以,Wa5小鼠在发育过程中,例如第二骨化中心形成,关节软骨维持,以及OA的进展中的各种变化,相对于CKO来说,在形态和功能上更接近于WT。在这里我们发现,Wa5小鼠的STB的结构形态,SBP的厚度,SBP的延迟像在DMM术前及术后无改变。由于Wa5小鼠的表型与WT小鼠非常相近,所以在本次的研究中,我们并没有包含Wa5的数据。DMM手术导致的CKO小鼠的SBP增厚是由于SBP骨髓侧的成骨增强和骨硬化蛋白减少造成的为了明确SBP增厚的机制,我们研究了新生骨的部位。骨钙蛋白染色显示,在CKO中DMM侧内侧的SBP骨髓侧的成骨细胞是是WT的6.6倍,而在DMM侧的外侧则无明显差别。这种骨增殖伴随着SBP表面的血管长度增加。这可能是因为局部的高合成代谢需要更多的营养支持所导致的。Wnts通路是成骨细胞合成新生骨的可能的通路之一。骨硬化蛋白是骨细胞分泌的Wnt通路的抑制剂。像骨干的皮质骨一样,位于SBP的骨细胞在细胞内及树突中,含有大量的骨硬化蛋白。显示骨钙蛋白在SBP的维持过程中可能具有重要的作用。在WT小鼠中,DMM手术并没有改变股骨内外侧骨硬化蛋白的量。而在CKO DMM的内侧,骨硬化蛋白的量明显减少,而外侧没有变化。定量分析显示,证实了我们的观察。这些数据显示,在关节软骨损伤下方的SBP中骨硬化蛋白的量减少,这可能是导致SBP仅在骨髓侧增厚硬化的原因。SBP在年老的CKO老鼠中增厚的机制与上述的CKO DMM模型相一致CKO可在6月大时自发的产生OA,但无SBP的变化。在12月大时,小鼠的STB的骨量减少并伴有其他结构参数的改变。与手术导致的OA模型不同的是,这种年龄相关的模型显示关节软骨的损伤位于关节的内外两侧。在组织学及显微CT的数据中可见,其两侧的关节软骨损伤导致了 CKO小鼠的股骨髁后侧的内外两侧显示出相同程度的SBP硬化。而WT和Wa5的小鼠,关节在这个年龄仍然保持健康。成骨细胞的染色显示,在CKO小鼠中内外侧分别增加了 10-15 倍。动态组织形态测量显示,新生的骨只位于骨髓侧而不位于SBP的软骨侧。BFR在CKO双侧大约为WT的3.5倍。更进一步显示,与WT相比SBP骨硬化蛋白的量在CKO的内外两侧明显的降低。在两种WT模型中,观察到了类似的SBP的变化为了证明我们的结论并不局限于EGFR敲除的小鼠,我们使用了 WT小鼠,建立了另外两种OA的模型。在DMM术后10月,WT小鼠显示出严重的OA表型,包括关节软骨的完全损伤及STB的骨量减少。与我们EGFR CKO小鼠模型结果相一致的是,在这些WT小鼠中,SBP的增厚仅仅位于股骨髁的后内侧,而其他3个位置没有影响。骨硬化蛋白的染色显示在DMM侧的内侧,骨细胞中硬化蛋白的水平下降。我们使用DMMH手术(DMM手术后同时切除内侧半月板)建模,这是一种比DMM更为严重的手术模型。术后16周可见WT显示出晚期OA的表型,关节软骨部分消失。同样,相一致的是,SBP的增厚仅仅出现在股骨髁后内侧。以上结论再次证明,SBP的硬化是骨细胞内硬化蛋白减少的结果。CKO小鼠关节软骨损伤导致局部SBP应力增加机械应力是骨硬化蛋白在皮质骨中的主要调节者之一。然而,目前并没有在活体动物中直接测量应力的方法。因此我们采用了非对称有限元分析的方法来模拟并估算DMM术后SBP及软骨的机械应力及其分布。我们利用前期工作中ATF-nanoindentatio分析所得到的参数进行建模,我们发现在非手术侧CKO中最大的应力约为WT的3倍。在CKO及WT中,最大的应力均出现在关节软骨的接触部位。在DMM术后,当关节软骨依然完整时,无论CKO或者WT,压力和拉力均在关节接触部位升高,而与基因型无关。这与其关节失去半月板的有效支持相关。在此时,CKO的关节软骨表面承受WT中2.9倍的拉力,这也说明CKO软骨更容易出现损伤。DMM同样增加SBP的拉力。但是这种增加的力与基因型无关。然而,当软骨完全磨损后,例如在CKO小鼠的OA晚期,在SBP的局部拉力增加14.6倍,这说明最大的力作用于SBP上。因此,应用有限元分析的方法,我们证明了 CKO小鼠内侧关节软骨的丢失大大增加了SBP的应力。这进一步证实了我们之前的结论,因为CKO SBP的骨硬化蛋白减少导致骨形成增加,并解释了 SBP增厚仅出现在CKO内侧的原因。结论:本次研究分为以下四个方面,即1.EGFR通路在关节软骨中的生理作用2.EGFR在骨关节炎的起始及发展过程中的作用3.一种基于显微CT技术的软骨下骨板(SBP)的3D研究方法。4.OA后期SBP硬化的机制及其影响。阐述了EGFR通路在维持关节软骨表层细胞方面具有重要的作用,并可以防止骨性关节炎的发生和进展。在OA晚期出现的软骨下骨板的硬化是由于损伤软骨下应力增多,骨硬化蛋白减少所致。