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干扰素(Interferon, IFN)是一类诱生型分泌性蛋白,具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能。目前重组干扰素已在大肠杆菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞中成功表达,大肠杆菌原核表达系统中,重组蛋白包涵体的复性和大肠杆菌热源性等仍是大肠杆菌作为表达干扰素的宿主菌亟待解决的问题。枯草芽孢杆菌作为肠道益生菌具有完善的分泌系统,能将外源基因产物分泌至胞外,有利于外源产物的纯化和回收。近年来,随着分子生物学和基因工程的发展,它作为基因工程表达系统发展迅速,作为新型的药物或抗原投递系统也展现出良好的应用前景。本研究通过克隆固始鸡IFN-α基因,进而构建大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达质粒pWBAO-ChIFN-α,并电转化到枯草芽孢杆菌工程菌WB800中。蛋白质免疫印迹法检测重组ChIFN-α的表达,微孔板细胞病变抑制法检测其抗病毒活性。试验一大肠杆菌-枯草芽孢杆菌-ChIFN-α穿梭表达质粒pWBAO-ChIFN-α的构建。提取免疫后鸡只的脾脏RNA通过RT-PCR,克隆489bp正确的鸡干扰素α基因。大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒的构建,解决连接产物转化进入枯草芽孢杆菌效率极低的问题。该穿梭质粒是以枯草芽孢杆菌表达质粒pWB980为质粒骨架,在pWB980质粒sacB信号肽前插入大肠杆菌的复制原点和氨苄抗性基因(1800bp),使其可以在大肠杆菌中复制。之后在大肠杆菌DH5a中构建了大肠杆菌-枯草杆菌-ChIFN-α穿梭表达质粒pWBAO-ChIFN-α。试验二重组质粒转化枯草芽孢杆菌的方法探究及表达条件优化。本试验通过化学转化法和电转化法将pWBAO-ChIFN-α质粒转化进入WB800。化学转化法：通过控制枯草杆菌在不同生长时期营养的需求,在营养贫瘠的情况下制备枯草芽孢杆菌WB800感受态细胞,以比较温和的转化方法导入表达质粒,该方法获得2-3个转化子；电转化法：在高渗溶液中制备WB800感受态细胞,以电击的方式导入表达质粒。电压的选择是电击转化方式是否成败的关键因素,因此在大量的实验摸索最后确定电击转化电压为1.0～1.2kv/mm,电击后电击常数在4.5～5.5ms。该方法一般情况下在抗性可以获得10～12个转化子,经菌液PCR检测阳性率为100%。因此,电转化法转化外源表达质粒的效率高于化学转化。优化枯草芽孢杆菌表达条件,确定最佳的表达时间。试验三检测重组鸡干扰素a在枯草芽孢杆菌中的表达和蛋白抗病毒活性。试验分为蔗糖诱导组和非诱导组,前者是在重组菌培养3h后加入终浓度为2%的蔗糖溶液进行诱导表达；后者在同样的条件下培养但无蔗糖添加。通过SDS-PAGE和蛋白试剂盒检测蛋白含量。Western blot检测到目的蛋白ChIFN-α的分子质量约为20ku的。微量细胞病变抑制方法检测ChIFN-α抗病毒活性：NDV感染MDCK细胞,设置空白对照、阳性对照、阴性对照、实验组进行检测。实验组在2-6稀释孔中细胞开始出现病变,表明该干扰素最小在2-6稀释度对细胞具有保护作用,表达的ChIFN-α具有抗病毒的生物活性。本研究结果表明,枯草芽孢杆菌作为肠道益生菌可以表达具有生物学活性的ChIFN-α,这也为肠道粘膜免疫的药物或免疫原投递载体的研究奠定了一定的基础。然而,枯草芽孢杆菌在表达外源基因时,分泌表达量少是后续实验需要解决的问题。