背景和目的原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC,简称肝癌)是常见的恶性肿瘤之一。虽然随着诊疗水平的不断提高和治疗方案的不断更新,肝癌患者的疗效日益显著,但其生存率并未显著提高,其主要原因是很多肝癌患者在初诊时已出现了转移。因此,探讨与肝癌转移相关的因素,寻找预防和治疗的有效途径,是当代肿瘤学研究的一项迫切任务。T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(T lymphoma invasion and metastasis1,Tiaml)基因是Dbl家族的鸟嘌呤核酸转换因子(guanine nucleotide exchange factor, GEFs)之一,通过参与多个信号传递通路调节细胞骨架重组、细胞周期进程、基因转录、细胞迁移和粘附等细胞生命活动,在肿瘤增殖、侵袭和转移过程中发挥重要作用。本课题组首先探讨了Tiaml蛋白在213例临床随访资料齐全的肝癌组织的表达情况,发现Tiaml蛋白在肝癌组织中高表达,而在正常肝组织中不表达,提示Tiaml可作为临床肝癌检测的重要肿瘤标志物；并结合213例临床随访资料回顾性分析Tiaml蛋白表达与肝癌患者生存期的关系,结果提示Tiaml与患者预后、转移密切相关,说明Tiaml可作为肝癌预后判断的重要指标,对判断肝癌预后有重要意义。在前期研究工作的基础之上,我们又进一步进行了Tiaml的功能实验,发现过表达Tiaml基因可促进肝癌低转移细胞株MHCC97L的增殖、迁移及侵袭能力；我们还构建了Tiaml的慢病毒干扰载体,包装慢病毒后感染高转移肝癌细胞HCCLM6,观察肿瘤细胞生物学特性的变化,发现Tiaml基因表达降低后,HCCLM6细胞增殖速度明显减慢、S期的比例明显减少、体外运动迁移、侵袭能力均明显降低。上述研究结果说明,Tiaml是一个重要的肝癌转移相关基因。但目前有关Tiaml在肝癌转移中的表达调控机制尚不清楚。MicroRNA (miRNA)是近年来研究发现的一类长约22nt的非编码单链小RNA分子,能以碱基互补形式结合到靶基因mRNA的3’UTR上,导致靶基因mRNA降解或翻译抑制,在转录后水平上对基因表达进行负性调控,研究显示miRNA可在转录后水平通过调控癌基因和/或抑癌基因的表达广泛参与肿瘤细胞增殖、凋亡、分化、侵袭、迁移、血管生成等,与多种肿瘤的发生、发展及预后关系密切。本研究将探讨参与调控Tiaml基因的]miRNAs及其在肝癌侵袭、转移中的作用,利用TargetScan、DIANA-microT和miRanda三个经典的miRNA靶基因预测数据库进行相互作用miRNAs的预测,得出miR-141和miR-106b为候选miRNA;采用RT-PCR方法检测了miR-141、miR-106b和Tiam1蛋白在6种肝癌细胞株中的表达趋势,初步筛选出miR-141为Tiaml相互作用的miRNA;利用荧光素酶报告系统验证了miR-141与Tiaml的3’UTR区存在特异性结合；通过原位杂交技术检测212例有完整随访资料的肝癌组织中miR-141表达,结果显示miR-141低表达与患者预后密切相关,临床参数分析显示miR-141低表达与转移密切相关,单因素和多因素分析显示miR-141低表达可作为肝癌预后的预后因素,提示miR-141可作为肝癌预后判断的重要指标,对判断肝癌预后有重要意义；通过抑制miR-141表达后能上调低转移潜能的MHCC97L肝癌细胞内Tiam1的表达,促进肝癌细胞体外增殖、迁移及侵袭能力；转染miR-141过表达病毒后能下调高转移潜能HCCLM3肝癌细胞内Tiam1的表达,抑制肝癌细胞体外增殖、迁移、侵袭及体内皮下成瘤和转移能力。研究将为Tiaml在肿瘤侵袭和转移中的分子机制提供新线索,为Tiaml基因和靶点miRNAs作为新的肝癌转移分子标志物提供科学依据。方法1、Tiaml相互作用miRNAs的筛选及鉴定(1)以Tiam1基因为检索词,利用TargetScan、DIANA-microT和miRanda三个经典的miRNA靶基因预测数据库进行相互作用miRNAs的预测,挑选预测值较高的miRNAs作为候选miRNAs;(2)选取6种肝癌细胞株,利用real-time RT-PCR检测候选miRNAs的表达,初步筛选与Tiam1相互作用的miRNAs;(3)利用荧光素酶报告系统检测Tiaml与筛选出的miRNA的结合情况,确定与Tiaml直接作用的靶点miRNA;(4)利用real-time RT-PCR和原位杂交方法,检测靶点miRNA在30对新鲜及212例肝癌组织中的表达情况,并进行相关性及临床病理参数分析。2、靶点miRNAs在肝癌侵袭和转移中的作用(1)利用阳离子脂质体法,将商品化的靶点miRNA inhibitor瞬时转染至肝癌细胞株MHCC97L中,用Western blot检测Tiaml的表达变化；(2)构建靶点miRNA’慢病毒表达载体,进行病毒包装后将之感染至肝癌细胞株HCCLM3中,筛选并获得靶点miRNA稳定表达的细胞株,用Western blot检测Tiaml蛋白的表达变化；(3)利用CCK-8法、细胞划痕实验和体外侵袭实验,检测靶点miRNA inhibitor转染后对体外癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响；(4)利用CCK-8法、细胞划痕实验和体外侵袭实验,检测靶点miRNA过表达对体外肝癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响；(5)体内试验检测靶点miRNA过表达对裸鼠皮下成瘤和转移能力的影响。结果1、Tiaml相互作用miRNAs的筛选及鉴定(1)三个数据库检索结果显示miR-141和miR-106b(三个软件均预测)的预测值较高；(2)Real-time RT-PCR结果显示,在30对肝癌组织中,miR-141和Tiam1的表达趋势相反,而miR-106b和Tiam1的表达无明显相关性,由于microRNA对靶基因起抑制作用,初步选定miR-141可能是Tiam1相互作用miRNA;(3)设计并构建Tiam1psi-CHECK2表达载体以及Mut Tiam13’UTR的突变载体；荧光素酶报告系统结果显示,在转染Tiam1基因psi-CHECK2载体的实验组中,miR-141组与对照blank组、NC组相比荧光素酶活性具有显著统计学差异(P=0.005,P=0.014)；而miR-141inhibitor组与NC inhibitor组、blank组相比,荧光素酶活性均无显著差异(P=0.267,P=0.496)。在转染Mut Tiam13’UTR突变载体的实验组中,miR-141组与blank组相比荧光素酶活性无显著差异(P=0.446),miR-141inhibitor与NC inhibitor组、blank组相比,荧光素酶活性均无显著差异(P=0.076,P=1.000)。以上证明miR-141能与Tiam1基因3’UTR区的两个结合片段相互作用,从而抑制了荧光素酶的活性；(4)在30对新鲜肝癌配对组织中,real-time RT-PCR结果显示,miR-141在肝癌组织中的表达明显低于正常肝癌组织(P<0.01)。原位杂交结果显示,miR-141主要在肝癌细胞胞核内表达。根据评分标准,在212例标本切片中,其中高表达91例,低表达121例。Spearman相关性分析显示212例肝癌组织中miR-141和Tiam1二者之间存在显著的负相关关系(r=-0.426,P<0.01)；miR-141表达与转移明显相关(P=0.027),但与肝癌患者的性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、肝硬化、复发、血清HBsAg.血清AFP均无相关性(P>0.05)。随访发现,miR-141低表达肝癌患者中位生存时间为32.0个月,低于miR-141高表达患者中位生存时间48.0个月,miR-141低表达患者与高表达患者生存时间有显著性差异(P=0.002)。将miR-141表达和临床病理参数综合与肝癌患者的生存时间进行单因素分析,结果显示miR-141低表达、肿瘤大小、转移、组织分化和血清AFP值是影响肝癌患者生存时间的重要因素(P=0.002;P=0.000;P=0.000;P=0.000;P=0.000;P=0.000)。多因素分析,发现miR-141低表达、肿瘤大小、转移、组织分化、肝硬化和血清AFP值分别是影响肝癌生存预后的独立因素(P=0.035;P=0.000;P=0.016;P=0.016; P=0.000)。2、转染miR-141inhibitor对肝癌细胞体外生物学特性的影响(1)将商品化的miR-141inhibitor转染肝癌MHCC97L细胞,real-time RT-PCR结果显示,与空载和NC组相比,三者间存在显著差异(F=11.823,P=0.026)；Western Blot结果显示,与空载和NC组相比,转染inhibitor后Tiaml蛋白的表达明显上调；(2)CCK-8法显示,与空载和NC组相比,MHCC97L细胞转染了miR-141inhibitor后,细胞增殖能力明显增强(P<0.01)；(3)细胞划痕法及体外侵袭实验结果显示,不同细胞在不同时间迁移能力有显著性差异(F=102.07, p=0.000); MHCC97L细胞转染了miR-141inhibitor后,细胞侵袭能力明显增强(F=174,P<0.01)。以上说明,抑制miR-141能促进肝癌细胞的体外迁移、侵袭能力。3、转染miR-141慢病毒表达载体对肝癌细胞体内外生物学特性的影响(1)成功构建了以绿色荧光蛋白为报告基因的miR-141慢病毒过表达载体,将慢病毒包装后转染至高转移潜能的肝癌细胞株HCCLM3中,并设立空白对照,将其命名为M3/miR-141+,同时空白对照细胞株命名为M3/mock,未经任何处理的细胞为M3。Real-time RT-PCR结果显示,与M3/mock细胞和M3细胞相比,三者间存在显著差异(F=6.379, P=0.037); Western Blot结果显示,与M3/mock细胞和M3细胞相比,miR-141过表达后Tiaml蛋白的表达明显下降。(2)CCK-8法显示,与M3/mock细胞和M3细胞相比,HCCLM3细胞转染了miR-141慢病毒过表达载体后,细胞增殖能力明显减弱(P<0.01)：(3)细胞划痕实验和体外侵袭实验结果显示,不同细胞在不同时间迁移能力有显著性差异(F=112.04,p=0.000)；与M3/mock细胞和M3细胞相比,M3/miR-141+细胞的侵袭能力明显减弱,差异具有统计学意义(F=11.10,p=0.002)。(4)我们观察稳定过表达miR-141后对肝癌体内增殖和转移能力的影响。将M3/mock细胞和M3/miR-141+细胞接种于裸鼠双侧背部皮下,通过30天连续的观察,我们发现特异性表达miR-141基因后,显著地降低了肝癌细胞的体内增殖能力(F=34.667,P=0.000),增殖差异从第15天开始,到第30天,差异达到最大,为1.6倍。采用尾静脉注射法建立了稳定表达miR-141前后肝癌细胞的裸鼠体内静脉转移瘤模型。2个月后处死裸鼠发现在M3/miR-141+组的12只裸鼠中仅有1只可观察到肺转移；而M3/mock组的12只裸鼠中有7只出现了肺转移；对各组裸鼠的其它器官组织切片观察显示两组裸鼠均未发现肝癌细胞的转移。以上说明,miR-141的过表达能抑制肝癌细胞的体外增殖、迁移、侵袭能力及裸鼠体内肿瘤生长、转移能力。结论1、miR-141是作用在Tiam1上的一个新型靶基因；2、miR-141通过靶基因Tiam1抑制肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭和转移能力。