研究背景创伤性脑损伤（traumatic brain injury,TBI）是神经外科常见病,致死致残率高,严重危害着人类的健康,是临床急需解决的问题。研究表明,TBI不仅可以造成脑组织的急性损伤,而且它是导致慢性神经退行性变的重要危险因素,因此,深入研究TBI后的病理生理机制,开发新的评估手段和有效治疗策略,对防治TBI具有重要的意义。对TBI的病理机制研究发现,TBI发生后,可引起一系列的病理改变,包括神经兴奋毒性作用、炎症反应、氧化应激、细胞死亡、脑微血管损伤诸如脑水肿、循环供血不足及血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）破坏等。这些继发性损伤反应高度关联且相互影响,最终加剧了TBI病理的复杂性。特别地,脑微血管损伤和BBB破坏被认为是TBI的重要病理损伤机制,可导致血浆蛋白外渗、组织缺血缺氧、脑内代谢废物聚积、胶质细胞激活及神经细胞损伤死亡等,最终对TBI患者的预后产生重要的影响,然而,其具体病理过程及机制尚未完全阐明。根据病情严重不同,TBI可分为轻度、中度和重度。其中,近85%病例为轻度创伤性脑损伤（mildTBI,mTBI）,其在急性脑损伤和慢性神经退行性变中的重要性正逐渐被认识到。越来越多临床及动物研究数据表明,mTBI可能与阿尔兹海默症、帕金森病以及慢性创伤性脑病等神经退行性疾病的发生密切相关。然而,到目前为止,有关mTBI后神经病理损伤机制上尚未完全阐明,mTBI后脑微血管损伤和BBB破坏的病理生理变化及意义的研究较少。这与mTBI本身的病理致病机制复杂性有关,也与脑微血管和BBB结构及功能的复杂性有关。对脑微血管及BBB的结构超微分析发现,其由内皮细胞、细胞连接蛋白、基膜、支持细胞（包括血管平滑肌细胞（VSMC）和周细胞）以及星形胶质细胞终足构成。值得一提的是,周细胞作为脑微血管和BBB的重要组件,对维持其正常结构和功能是必不可少的。研究发现,脑周细胞缺失参与了急性脑损伤和慢性神经退行性变的病理过程,但由于缺乏特异性的细胞标志物,目前对脑周细胞在中枢神经系统病理生理状态中的作用的研究仍然具有挑战性。本课题拟在构建闭合性脑损伤动物模型的基础上研究mTBI后脑微血管损伤和BBB破坏的病理改变情况,探讨mTBI对小鼠脑微血管和BBB结构功能的影响;同时,基于单细胞测序分析及转基因动物构建等技术探索验证Atp13a5为脑血管周细胞特异的生物标记物,为今后继续研究包括TBI在内的神经系统疾病的脑微血管损伤机制提供新的研究思路和方法。1.轻度创伤性脑损伤后脑微血管及BBB的病理变化研究目的本实验拟检测评估mTBI后脑微血管损伤及BBB破坏情况,了解其在mTBI后继发性损害过程中的病理特点,为继续深入研究探讨脑微血管损伤及BBB破坏在mTBI病理过程中的作用开拓新思路和提供必要的理论基础。研究方法根据不同的实验内容,该研究分三部分:（1）利用控制性脑皮质撞击（controlled cortical impact,CCI）方法制作闭合性mTBI小鼠模型,并与重度TBI（severeTBI,sTBI）作比较,采用神经功能学评价（m NSS评分、Rotarod和Foot-fault试验）、Tunel染色、组织化学染色、脑组织含水量测定等技术方法,评估mTBI后急性/亚急性期脑微血管损伤及BBB破坏情况。（2）利用组织化学染色及激光散斑衬比分析成像技术（Laser Speckle Contrast Imaging,LSCI）等手段评估mTBI后BBB重要组分（包括脑血管周细胞及基膜）的损伤变化、血管周围间隙的改变以及微血管血流量情况,以探讨mTBI对脑微血管、BBB、周细胞及基膜的影响。（3）通过测定mTBI后脑组织中Evans blue及Alexa Fluor 555-cadaverine含量,结合组织化学染色分析其与皮层和海马脑组织中GFAP+星形胶质细胞和Iba-1+小胶质细胞增生激活之间可能的相关性,探讨mTBI后BBB破坏的病理意义。研究结果（1）较sTBI相比,mTBI引起小鼠短时间内的神经功能障碍,于损伤后3d恢复;病理学检查提示:较sTBI相比,mTBI在损伤后1d未造成明显脑组织缺损及脑组织水肿发生,损伤后3d未引起明显的Neu N+神经元死亡。组织化学染色提示:较sTBI相比,mTBI在损伤3d后引起较轻的Iba-1+小胶质细胞和GFAP+星形胶质细胞活化。（2）甲酚紫染色显示:mTBI小鼠脑组织切片脑血管周围间隙扩大;Evans blue染色显示,损伤后1d,mTBI引起的Evans blue渗漏主要发生在损伤侧皮层表浅区域;相较而言,sTBI可造成严重而广泛的Evans blue渗漏,可深至海马区域。内源性Ig G和Fibrin及外源示踪剂555-cadaverine染色显示:损伤后3d,mTBI引起的上述物质脑血管外的渗出较对照组仍明显增多。组织化学染色提示:损伤后3d,mTBI损伤侧皮层脑组织内CD13+血管周细胞数量及覆盖率较对侧明显减少,尽管两者在毛细血管总长度上无明显差异;Pearson’s关联性分析提示:mTBI后,血管外Fibrin的蓄积与血管周细胞覆盖程度减少成正相关;此外,损伤3d后,mTBI损伤侧皮层脑组织内Collagen IV和Lamininα2较对侧明显表达升高,而Lamininα4的表达则明显下降。LSCI提示:损伤3d后,mTBI可引起损伤侧皮层脑组织内脑血流量减少~50%。（3）555-cadaverine染色显示:mTBI后其在损伤侧皮层脑组织内积聚,于伤后1d最为明显,随后逐渐降低,但较假手术组小鼠仍明显增多;而在海马组织中,其在损伤后第1,3,8d也均可检测到,于伤后3d最为明显;免疫组织化学染色显示:mTBI后第3d和8d损伤侧皮层和海马脑组织中GFAP+星形胶质细胞数量明显增多;Iba-1+小胶质细胞则在伤后1,3和8d均明显增多。研究结论mTBI可引起小鼠脑微血管损伤、BBB破坏、血管周细胞缺失、基膜改变以及脑血流量减少,最终参与mTBI后病理过程。2.Atp13a5作为脑血管周细胞特异的生物标记物的分析与验证研究研究目的本实验拟基于单细胞测序数据分析及转基因动物构建等技术探索验证潜在的脑血管周细胞特异性表达的生物标记物,验证分析Atp13a5作为脑血管周细胞特异的标记物在小鼠脑内的表达及分布状况,以期为今后继续研究探讨脑血管周细胞及BBB病理改变在包括TBI在内的中枢神经系统疾病致病过程中的作用开发新的研究工具。研究方法（1）通过对脑血管单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing,sc RNA-seq）数据库进行二次分析,比较脑内不同细胞亚群的转录信息,发掘脑血管周细胞潜在的特异表达的标记物。（2）基于对sc RNA-seq数据的分析结果,结合原位杂交及组织化学染色技术,分析Atp13a5 m RNA在脑内及外周脏器（如心、肝、肾）的血管周细胞中的表达状况,探讨其在脑血管周细胞内的表达及与生长发育的关联性。（3）在构建Atp13a5-2A-Cre ER-IRES-td Tomato knockin转基因小鼠的基础上,结合PCR及免疫组织化学染色等技术,探讨Atp13a5在脑血管周细胞内的表达状况及其与脑内其他细胞分布间的关系性。研究结果（1）scRNA-seq数据分析表明,与Vtn和Kcnj8这两种泛血管周细胞标记分子不同,Atp13a5特异性高表达于脑血管周细胞中。（2）显色原位杂交结果提示,Atp13a5 mRNA在不同脑区广泛表达,包括皮质、海马、纹状体、丘脑、中脑、脑桥及小脑。荧光原位杂交结果提示,Atp13a5 m RNA特异性共表达于皮层脑组织CD13+血管周细胞上,而非Lectin+内皮细胞上。并且,Atp13a5 m RNA也不表达于外周脏器（如心、肝、肾）中。（3）sc RNA-seq数据分析表明,Atp13a5 m RNA在围产期周细胞中有表达,从幼年期开始增加至成年期水平并维持在稳定表达水平。荧光原位杂交结果提示,Atp13a5 m RNA在E15脑片中几乎无法检测到,从P0开始表达逐渐增多,于P10时达到稳定水平,与8W和18M时表达无明显差异。（4）在8周龄的Atp13a5-2A-Cre ER-IRES-td Tomato knockin小鼠中,整个冠状脑切片上均可检测到td Tomato信号;组织化学染色结果显示:td Tomato信号沿着Lectin+毛细血管内皮细胞分布,而非VCAM1+静脉或SMA+动脉血管平滑肌细胞。并且,td Tomato信号表达于CD13+脑血管周细胞中,重合率达97.3±1.4%。此外,Td Tomato信号未表达于Oligo+少突胶质细胞、Neu N+神经元、Iba-1+小胶质细胞以及GFAP+星形胶质细胞上。研究结论Atp13a5是一种脑血管周细胞特异的生物标记物,在今后研究脑血管周细胞及BBB病理改变在包括TBI在内的中枢神经系统疾病致病过程中的作用时具有潜在的应用价值。