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从1977年Gilliland提出乳酸菌能够降低胆固醇以来,许多的研究都对此进行了证实和深入研究,普遍提出乳酸菌代谢中产生的胆盐水解酶在其降胆固醇作用中的重要作用。胆盐水解酶在体内将结合型胆盐水解成游离胆盐和游离氨基酸,机体中的结合型胆盐含量下降,加快体内胆固醇作为前体合成结合胆盐的速度,从而有效的降低胆固醇含量。本实验研究对象为筛选确定具有高效降胆固醇能力的乳酸菌,并经16sRNA确定是发酵乳酸菌,命名为发酵乳杆菌Lactobacillu. fermentum DF-4。目前,研究文献中发现具有降胆固醇能力的发酵乳酸菌较少,具有较大的研究价值。本研究参照GenBank中登录的胆盐水解酶基因序列(EU477374),利用Primer5软件设计1对扩增BSH编码区序列的特异性引物,并PCR克隆目标基因。经同源蛋白对比分析设计引物,确定PCR扩增获得的是发酵乳杆菌bsh基因(975bp)。试验采用基因重组技术,将bsh基因重组至多个表达载体中,并转化至大肠杆菌(E.coli)宿主中。经IPTG诱导表达后,发现将bsh基因导入不含任何融合标签的pET-28a上,重组菌E.coli Rosetta[pET-28a-BSH]中的目标蛋白多为包涵体的形式存在。而将bsh基因导入分别含有融合蛋白基因IF2、SUMO、GST、NusA和MBP等的质粒中,重组菌E. coli Rosetts(DE3)[pLS932-BSH]和E.coli Rosettc(DE3)[pLS942-BSH]中的目标蛋白的溶解性大大提高,经过SDS-PAGE电泳检测分析确定,融合标签MBP的改善溶解性效果最佳。试验采用超声破碎的方法进行细胞破碎和粗酶液的提取。通过超声破碎工艺探究,确定菌悬液浓度为0.01g/mL,破碎体积9mL,破碎频率200w、5s-10s-5s,破碎120次为最佳粗酶液提取参数。试验采用Ni-NTA Resin进行目标蛋白纯化。通过对不同连接位置的蛋白纯化效果对比,结果显示前者Ni-NTA Resin效果更好,并且C端融合His-Tag更有利于其与Ni离子结合,MBP-BSH蛋白纯化量更大,杂带更少。茚三酮显色反应测定酶活力,结果显示纯化后的MBP-BSH的比酶活力为62.365U/mg。本研究结果证明了融合标签MBP能够有效的改善异源表达BSH的可溶性,并且MBP-BSH蛋白仍具有胆盐水解酶的功能。