目的:通过生物信息学和体内外实验等方法鉴定一对新的TA系统mt-Pem IK,构建H37Rv△Pem K敲除株,观察mt-Pem IK对耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌生长的影响,进而揭示其在结核分枝杆菌中的功能和作用机制,补充和完善结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统的功能,进一步阐释结核分枝杆菌持留及致病性形成的相关机制。方法:首先,运用生物信息学的方法在结核分枝杆菌基因组中搜索并寻找一对新的TA系统,分析其结构特点是否属于TA系统,以耻垢分枝杆菌为模式生物,验证mt-Pem K和mt-Pem I的功能及相互作用机制,分析其功能是否符合TA系统的特点;其次,运用噬菌体介导的同源重组方法构建H37Rv△Pem K敲除株,并经PCR、实时荧光定量PCR及测序等方法进行验证,然后观察野生株H37Rv和敲除株H37Rv△Pem K在正常培养和不同压力应激培养条件下的生长情况;再次,分别构建野生株和敲除株RAW264.7细胞感染模型,比较CFU计数、细胞因子表达水平和细胞凋亡水平变化的差异;最后,分别构建野生株和敲除株动物感染模型,观察小鼠一般情况,比较肺脏、脾脏病理形态、CFU计数及细胞因子表达水平的差异。结果:1.在结核分枝杆菌基因组中发现了一对新的TA系统,称其为mtPem IK。当在耻垢菌株中导入mt-Pem K并诱导表达,发现其产物Pem K蛋白具有抑制耻垢分枝杆菌生长的毒性作用,蛋白Pem I可以发挥拮抗Pem K的毒性作用,使生长抑制的耻垢菌株恢复正常生长,Pem I为抗毒素蛋白,证实mtPem IK是一个典型的II型TA系统。2.提取H37Rv△Pem K敲除株的DNA和RNA,经PCR、实时荧光定量PCR及测序等方法证实敲除株构建成功。3.在正常培养条件下,结核分枝杆菌野生株与敲除株生长差异无统计学意义,但在各种压力应激条件下,无论是野生株还是敲除株生长均明显受到抑制,其中在酸性PH、高渗透压、厌氧的条件下,敲除株比野生株生长更慢。4.细胞实验显示,在感染0h、24h、48h,野生株组CFU计数比敲除株组均高,感染0h差异具有统计学意义;在感染24h,野生株组的IL-1α、IL-10达分泌最高峰,与敲除株组相比差异具有统计学意义,而敲除株组分泌高峰延迟;在感染4h,实验两组均出现IL-6分泌最高峰,在感染24h两组差异具有统计学意义;在感染48h,野生株组出现IL-12分泌最高峰,而敲除株组在感染72h出现分泌最高峰;在感染0h,野生株组与敲除株组TNF-α均达分泌最高峰;感染72h,野生株组IFN-γ分泌水平明显升高,与敲除株组相比差异有统计学意义;随着感染时间的延长,野生株组与敲除株组诱导的凋亡率均逐渐升高,在感染24h,敲除株组诱导的凋亡水平更高,两组差异有统计学意义。5.动物实验显示,在感染最初的2月,敲除株组小鼠体重增长速度、组织炎症反应程度及CFU菌落计数情况均较野生株组小鼠加重,在感染最初1月、2月,主要以敲除株组血浆IL-6、IL-10的分泌水平升高为主,而在感染3月时,则以野生株组血浆IFN-γ的分泌水平升高为主。结论:本研究发现并鉴定了结核分枝杆菌一个新的TA系统mt-Pem IK;利用高滴度噬菌体介导的基因重组工程技术构建结核分枝杆菌基因敲除株的方法可行;在压力应激条件下,TA系统可能参与了结核分枝杆菌的生长调控,其中,mt-Pem IK参与调控的条件与酸性PH、渗透压及厌氧的压力应激条件有关;体外细胞实验证实,野生株的存活能力和毒力均强于敲除株;动物实验证实,mt-Pem K基因可能通过影响结核分枝杆菌的毒力,调控其生长。