β-甘露聚糖酶因能将半纤维素中的甘露聚糖水解成小分子物质而广泛应用于生物能源、食品加工、饲料制造和石油开采等工业领域。在工业生产中,对甘露聚糖进行处理时往往需要用到具有高活性与良好热稳定性的β-甘露聚糖酶。本课题组前期筛选到了一株嗜热厌氧杆菌Thermoanaerobacterium aotearoense SCUT27,成功克隆了其β-甘露聚糖酶（Man25）的基因,并在E.coli BL21（DE3）表达。Man25显示出许多优良的特性,如较高的比酶活和在pH 3-8之间能保持很好的稳定性。然而Man25的热稳定性较差,因此为了使Man25更适合工业应用,本研究基于Ca2+结合位点对Man25的热稳定性定向进化。首先,我们通过蛋白序列比对和同源建模确定了Ca2+结合位点为E32、E34、S53、G56和D143。对构建的Man25模型与底物进行分子对接,结果显示Ca2+结合位点远离底物催化活性位点,由此我们推测Ca2+结合位点的改造对该酶催化活性影响较小。为了对更多的突变体进行筛选,我们建立了一种基于E.coli BL21（DE3）中T7启动子可以渗漏表达且细胞高温可裂解的胞内β-甘露聚糖酶平板初筛方法。菌株在50℃下培养12 h便实现细胞的裂解,产生清晰的水解圈,其EI值为3.78±0.07。此方法的优点是便捷、快速、周期短、高通量以及无需添加诱导剂。通过对Ca2+结合位点饱和突变和高通量筛选,我们最终获得了两个热稳定性提高的突变体D143A和E32K/E34S,与Man25相比,其半衰期分别延长了3.6和1.8倍,比酶活分别提高了20%和7%;另外,D143A和E32K/E34S的Vmax分别提高了11%和3.7%,其Km值也差别不大,表明酶热稳定性的提升没有使酶催化活性丧失。通过分子动力学模拟对D143A和E32K/E34S两个突变体进行分析,其回旋半径与溶剂可及面积均变小,表明突变后两个突变体的内部相互作用更强,蛋白折叠更紧密,因此热稳定性得到提高,可能与D143A突变增强疏水作用、E32K/E34S突变产生氢键有关。在本研究中,我们借助建立的胞内β-甘露聚糖酶高通量筛选方法成功在Ca2+结合位点突变文库中筛选到了热稳定性更高的两个突变体,结果表明金属离子结合位点的突变可以提高β-甘露聚糖酶的热稳定性,我们的策略为拥有金属离子结合位点的β-甘露聚糖酶热稳定性的改造提供了新的思路。此外,我们建立的简单的初筛方法可以应用于其他表达于E.coli BL21（DE3）胞内的嗜热酶的高通量筛选中。