细胞缺氧是严重烧伤最常见的病理生理现象之一。以往的研究发现,严重烧伤及伤后早期导致的组织细胞缺血缺氧、炎症介质释放是导致早期“休克心”的两大主要因素。如何减轻、遏止其介导的心肌损伤效应是防治“休克心”的关键。近年来,如何调动机体自身的抗损伤机制逐渐引起大家的注意。严重烧伤及伤后早期导致的组织细胞缺血缺氧、炎症介质释放等因素作为严重的应激必然会诱导机体产生强烈的应激反应,而热休克蛋白是生物体在不良环境因素作用下所产生的一组具有高度保守性的应激蛋白。热休克蛋白90(heat shock protein 90, HSP90)是维持细胞内蛋白构象稳定与功能正常所必需的分子伴侣,也是公认的与应激耐受密切相关的保护性分子。HSP90通过催化损伤和变性的蛋白质再折叠,或者促进损伤严重的蛋白质解聚,从而保护细胞免受由应激所导致的损伤。此外,HSP90还与体内各种应激信号转导通路中多个关键分子相互作用,增强细胞对损害的耐受程度,提高细胞的生存率,在抗凋亡作用中扮演重要角色。我们推测,在缺氧条件下,心肌细胞中的HSP90会发生一定量的变化,从而影响其下游的效应分子发挥作用。本研究旨在验证上述设想,明确缺氧条件下心肌细胞中HSP90的表达变化情况及分布,探讨缺氧引起的HSP90变化是否对缺氧心肌细胞有保护作用,为临床防治“休克心”提供新的思路和实验依据。一、研究目的:明确HSP90在心肌细胞中随缺氧时间变化的表达变化规律及分布情况,观察其在早期心肌缺氧损害中的保护作用。二、材料方法1、心肌细胞的培养及缺氧处理:胰酶消化法培养心肌细胞。为模拟烧伤后心肌缺氧环境,配制94%N2、5%CO2、1%O2的混合气体,作为心肌细胞的生长环境,将心肌细胞放置于密闭缺氧罐中,通上述混合气体,最终氧浓度为1%,进行缺氧处理。2、实验分组:将心肌细胞随机分为对照组(常氧组、A组)、缺氧组(B组)、常氧+GA组(C组)、GA预处理后再缺氧组(缺氧+GA组、D组)。将B组、D组培养的细胞按照缺氧时间分组标记,分别选取1h、3h、6h、12h、24h时相点进行观察研究。3、蛋白含量测定:免疫印迹法(Western Blot,WB)半定量HSP90蛋白含量变化。4、分布形态研究:通过荧光显微镜应用免疫荧光化学染色法进行观察。5、用CCK-8试剂盒检测各组心肌细胞的活力情况。6、取培养心肌细胞上清液检测各组LDH、CK-MB、肌钙蛋白I的含量变化。三、主要结果1、分析WB结果得知,正常心肌细胞中HSP90含量较低,缺氧3h后HSP90蛋白表达量有所增加,增加趋势一直持续到缺氧后12h达到峰值,缺氧24h后HSP90含量有所下降,与缺氧后1h接近。而用HSP90特异性阻断剂GA后心肌细胞在缺氧后各个时相点的表达含量均明显降低。2、正常心肌细胞中HSP90呈颗粒状分布在细胞胞浆中,分布不均,密度较低。随着缺氧时间的延长,细胞胞浆中HSP90的表达增加,表现为荧光强度增强,且融合成片。通过图象分析量化胞浆中HSP90的免疫荧光强度变化发现,缺氧6h后HSP90蛋白的荧光强度值开始增加,一直持续到缺氧后12h。3、与正常对照组相比,单纯缺氧组6h后心肌细胞的活力下降,随着处理时间的延长,缺氧12h、24h活力下降显著;与单纯缺氧组相比,GA+缺氧组在6h后心肌细胞的活力下降,缺氧12h、24h下降显著。4、与正常对照组相比,单纯缺氧组各个时相点中CK-MB含量有显著升高;与单纯缺氧组相比,GA+缺氧组在各个时相点中CK-MB含量有显著升高。5、与正常对照组相比,单纯缺氧后除缺氧1h外,其余各个时相点LDH含量有显著升高;与单纯缺氧组相比,GA+缺氧组在各个时相点中LDH含量有显著升高。6、与正常对照组相比,单纯缺氧组在缺氧3、6、12h肌钙蛋白I含量有显著升高;与单纯缺氧组相比,GA+缺氧组在缺氧1、3、6、12h肌钙蛋白I含量有显著升高。四、全文结论1、缺氧对心肌细胞中HSP90含量的变化有一定作用。在缺氧早期12h之内,HSP90含量的变化随着缺氧时间的延长而逐渐增加,有时间依赖性;到缺氧24h后HSP90含量有所下降。2、缺氧导致HSP90的分布变化发生在细胞胞浆中,说明其与下游分子的作用也发生在胞浆中。3、运用HSP90特异性阻断剂GA阻断HSP90表达后,心肌细胞活力在缺氧6、12、24h下降,反应心肌细胞损伤的特异性的酶LDH、CK-MB在缺氧后各个时相点均显著升高,肌钙蛋白I含量在缺氧1、3、6、12h显著升高,结合HSP90表达情况,说明HSP90在对早期缺氧心肌细胞有保护作用,这为临床防治“休克心”提供了新的思路和实验依据。