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蛋白质泛素化是由泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3共同作用将泛素分子呈递到特异性底物上并将其进行泛素化修饰的过程。这个过程主要由E3泛素连接酶复合体决定底物的特异性。Cullin-RING是哺乳动物中最大的E3泛素连接酶家族。CUL4B是Cullin-RING泛素连接酶的骨架蛋白，CUL4B的氨基端与DDB1相结合，CUL4B的羧基端与RING finger蛋白ROC1相结合，从而形成的CUL4B-DDB1-ROC1复合物称为CRL4B E3泛素连接酶复合体。CRL4B主要参与表观遗传调控和底物蛋白泛素化降解过程。CRL4B E3泛素连接酶在介导底物泛素化降解过程中，主要依赖CUL4-DDB1相关因子(DDB1and CUL4-associated factors，DCAFs)实现底物的特异性识别。与DDB1相连的DCAFs是一类含有WD40重复序列的蛋白质，目前研究表明有多种DCAFs与DDB1存在相互作用，其中部分DCAFs的底物蛋白已有报道，如WDTC1的底物组蛋白H2A、COP1的底物c-Jun、CDT2的底物CDT1和AhR的底物ER-α等。 过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptors，PPARs)属于配体依赖型核受体家族，分为α、β/δ、γ三种类型，其中针对PPARγ的研究最为广泛。PPARγ又分为PPARγ1和PPARγ2两种亚型，这两种亚型表达具有组织特异性。PPARγ1在除肌肉以外的其他组织中均有表达，PPARγ2则主要在脂肪组织中表达。在本论文中，研究的PPARγ是PPARγ2。PPARγ具有多种生物学功能，现已有研究证明PPARγ是调节细胞分化的重要基因，并参与多种分子机制的调控，包括脂质和葡萄糖糖酵解过程。PPARγ与多种疾病相关，如Ⅱ型糖尿病、高血压等。据报道，激活PPARγ可以提高机体对胰岛素的敏感性。此外，PPARγ还可以作为E3泛素连接酶参与降解NFκB/p65。同时PPARγ生物学功能还受多种E3泛素连接酶调控。2014年有研究发现PPARγ受MKRN1(makorin ring finger protein1)E3泛素连接酶调控，K184和K185是PPARγ被MKRN1泛素化修饰的两个赖氨酸位点。2016年有研究发现FBXO9(F-box only protein9)是PPARγ的E3泛素连接酶，调控PPARγ的功能和蛋白质稳定性。2017年实验室李培山老师发现PPARγ可以被CRL4B E3泛素连接酶泛素化修饰并降解，从而影响脂肪细胞分化和机体对胰岛素的敏感性，但底物PPARγ被泛素化修饰的分子机制尚不清楚。 芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AhR）是一类依赖配体激活的转录因子，属于碱性螺旋-环-螺旋家族。通常情况下AhR可以与环境中多种多环芳烃类毒素结合，然后与AhR核转运蛋白(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，ARNT)形成异二聚体，进入核内与外源性化合物调节元件结合，启动下游细胞色素P450家族基因表达。AhR还可以参与肿瘤的发生与发展。2017年有研究发现AhR是垂体瘤中潜在的肿瘤抑制因子。此外配体激活的AhR可以作为CRL4BAhR复合物中DCAF元件，特异性识别雌激素受体α(estrogen receptorα，ER-α)并参与介导其降解过程。 目的: 基于以上研究背景，本课题主要研究PPARγ被CRL4B泛素化修饰的分子机制，明确CRL4B E3泛素连接酶复合物中识别PPARγ的DCAF，研究该DCAF与PPARγ相互作用机制以及底物PPARγ被CRL4B E3泛素连接酶泛素化修饰的赖氨酸位置。 方法: 首先检测了小鼠不同组织中COP1、CDT2、WDTC1、AhR的表达情况，然后在3T3-L1细胞中采用免疫共沉淀方法发现可以结合PPARγ的DCAF可能是AhR。同时半衰期实验结果表明AhR可以影响PPARγ蛋白质稳定性，加入AhR可以使PPARγ蛋白质半衰期缩短。 发现AhR参与介导CRL4B E3泛素连接酶对底物PPARγ泛素化修饰过程。3T3-L1细胞中免疫共沉淀实验结果证明AhR是CRL4B E3连接酶复合物组成元件并且与PPARγ存在相互作用。细胞内和细胞外泛素化实验结果表明加入AhR可以提高PPARγ泛素化水平。HEK293T细胞内泛素化实验结果表明PPARγ主要是通过泛素-蛋白酶体途径降解。 结果: HEK293T细胞中免疫共沉淀实验结果表明PPARγ和AhR相互作用位点位于PPARγ的1-232氨基酸区域。 HEK293T细胞内泛素化实验结果表明PPARγ发生泛素化的赖氨酸位点位于PPARγ的233-505氨基酸区域，并且靠近PPARγK347位点。 结论: 本研究深入探索了PPARγ被CRL4B泛素化修饰的分子机制，可以为抑制PPARγ的泛素化降解，提高或稳定PPARγ蛋白质水平，增强PPARγ功能提供新的思路。本研究同时明确了PPARγ对应的DCAF，该DCAF可能可以作为新的药物靶点，用于特异性治疗与PPARγ功能密切相关的疾病如Ⅱ型糖尿病、高血压等。