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木瓜蛋白酶是一种纯天然的植物蛋白酶,不仅具有较强的蛋白酶水解和合成能力,还具有凝乳、解脂、溶菌活力。因此,其被广泛应用于食品、医药、饲料、化妆品、皮革等工业领域。但游离酶易失活变性,催化效率低,从而限制了其在工业生产中大规模的使用。固定化是解决游离酶中不足的有效方法,它不仅能保持游离酶的催化反应特性,还具有良好的稳定性、重复使用性、易分离回收、能够连续操作等优点。而传统的固定化方法普遍存在固定化使用试剂和载体成本高,固定化操作过程繁琐等缺点,使固定化酶的产业化应用受到了一定的限制。因此,合理选择和制备性能优良的固定化载体和简单有效地固定化方法对固定化酶的制备具有重要的意义。本文制备出了两种性能优良的固定化载体,再利用金属螯合层析的方法用于木瓜蛋白酶的固定化,并将其固定化酶用于大豆分离蛋白的水解。此固定化方法简单方便,对蛋白质构象影响很小,酶活力损失小,载体还可以重复利用。主要研究内容如下:（1）以壳聚糖粉末为原料,纳米级Fe3O4作为磁性材料,SiO2为致孔剂,制备出多孔磁性壳聚糖微球（Porous Chitosan Magnetic Microspheres,PCMM）。以环氧氯丙烷（Epichlorohydrin,ECH）作为PCMM的活化剂,探讨了活化温度、活化时间、二甲亚砜浓度、氢氧化钠浓度、ECH体积分数对PCMM表面上的环氧基密度的影响,确定PCMM最佳的活化条件。经亚氨基二乙酸（Iminodiacetic Acid,IDA）和羧甲基化天冬氨酸（Carboxymethylated Aspartate,CM-ASP）处理后,使PCMM带上不同的螯合基团,再分别吸附Cu2+、Ni2+金属离子后,制备PCMM-IDA-Cu2+和PCMM-CM-ASP-Ni2+两种多孔磁性金属螯合载体。用光学显微镜、扫描电镜（SEM）、振动样品磁强计（VSM）、红外光谱分析（FI-TR）和热重分析（TGA）等方法对PCMM-IDA-Cu2+载体和PCMM-CM-ASP-Ni2+载体进行表征分析。（2）以自制的两种多孔磁性金属螯合载体PCMM-IDA-Cu2+和PCMM-CM-ASP-Ni2+为载体,用于木瓜蛋白酶的固定化研究。通过单因素试验,探讨了固定化时间、给酶量、固定化pH和固定化温度对木瓜蛋白酶固定化效果的影响。在单因素试验的基础上,采用响应面分析的方法（RSM）优化酶固定化的条件,得到最佳固定化条件为:PCMM-IDA-Cu2+载体:固定化pH 6.73,给酶量为1.56 mg/15mg,固定化温度30.9℃,固定化酶活力为7.976 U/mg;PCMM-CM-ASP-Ni2+载体:固定化pH 7.29,给酶量为1.90 mg/15 mg,固定化温度30.7℃,固定化酶活力为7.397 U/mg。在最佳的固定化条件下,测得的酶的固载量分别为 94.18 mg/g（PCMM-IDA-Cu2+）和 89.16 mg/g（PCMM-CM-ASP-Ni2+）,固定化酶活力回收率分别为87.21%（PCMM-IDA-Cu2+）和81.63%（PCMM-CM-ASP-Ni2+）。（3）系统的比较了游离酶和固定化酶的酶学性质,可以为实际应用提供一些理论依据。结果表明:木瓜蛋白酶经两种载体（PCMM-IDA-Cu2+和PCMM-CM-ASP-Ni2+）固定化后,最适反应温度均为70℃,且两种固定化酶在60℃～90℃范围内都保持了较高的酶活力。游离酶的最适pH为7.0,两种固定化酶的最适pH为8.0,在较宽的pH（6～10）范围内固定化酶均表现出较高的酶活,表明固定化酶比游离酶更耐酸碱性。固定化酶的稳定性都明显高于游离酶。游离木瓜蛋白酶Km值1.59 mg/mL,固定化酶的Km值分别为（PCMM-IDA-Cu2+）0.99 mg/mL和（PCMM-CM-ASP-Ni2+）0.25 mg/mL,表明固定化酶比游离酶对底物更具有亲和力。固定化酶重复使用9次后,PCMM-IDA-Cu2+和PCMM-CM-ASP-Ni2+固定化酶活性仍然保留在60%以上。载体在重复利用6次后,酶固载量分别可达到68.81 mg/g（PCMM-IDA-Cu2+）和65.21 mg/g（PCMM-CM-ASP-Ni2+）。（4）用两种自制的固定化酶在食品中的应用进行初步研究,对大豆分离蛋白进行水解。以水解度为指标,系统的研究了温度、水解时间、底物浓度、给酶量、pH对大豆分离蛋白水解度的影响,通过上述试验,确定了两种固定化酶对大豆分离蛋白水解的最佳条件均为:给酶6000U/g,反应时间2h,底物浓度4%,温度70℃,pH为8,为其在实际生产应用中提供了相关的理论基础。