低温等离子体技术作为近年发展起来的一种新技术,引起了大量科研工作者的关注,目前在多个医疗领域得到应用:如细菌的灭活、血液的凝固、器械的消毒、牙齿的美白、癌细胞处理等。近年来,医学专家将该方法应用于肿瘤治疗,并获得了许多重要的研究结果。本研究充分利用了低温等离子体有效性、特异性等的特点,将该方法应用于白血病的治疗研究,证实了该方法可以有效杀伤白血病肿瘤细胞,并可诱导细胞凋亡。研究目的本课题主要研究介质阻挡放电(Dielectric barrier discharge,DBD)低温等离子体对白血病细胞的杀伤效应,初步研究低温等离子体促进肿瘤细胞凋亡的分子机制,为低温等离子体技术在肿瘤的杀伤与治疗方面的应用提供初步的理论基础,为等离子体技术真正在白血病临床治疗提供初步的实验依据。研究方法本课题以大鼠急性早幼粒白血病细胞系LT-12为实验对象,使用不同剂量低温等离子体对细胞进行处理,通过MTT分析方法检测细胞的相对存活率;使用Annexin V-488/PI双染法检测处理后细胞不同时期的凋亡率;通过高内涵成像系统观察不同凋亡时期细胞的染色图;使用活性氧试剂盒检测等离子体处理后细胞内活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)含量的变化;通过qRT-PCR法检测低温等离子体处理后细胞凋亡相关基因表达水平的改变,并采用免疫印迹法Western Blot法检测低温等离子体对凋亡相关蛋白表达的影响。研究结果1.MTT实验结果表明,等离子体对白血病细胞的杀伤效应呈现出剂量和处理后经过的时间依赖性,随着处理剂量从30s到240s,处理完8h后细胞的存活率从98%降至63%,在同一剂量下,如240s,细胞的存活率从处理后2h的78%降至处理后24h的39%。2.Annexin V/PI双染法的实验结果表明,低温等离子体可引起细胞凋亡,凋亡率不但与等离子体的剂量呈正相关性,还与等离子体处理后所经过的时间呈现一定的相关性,等离子体处理后所过去的时间越长,细胞的凋亡率会越高,如当等离子体处理后8h,细胞的凋亡率从60s的23.8%提高到了120s的28%,处理12h后,细胞的凋亡率从60s的48%增加到了120s的55.3%。3.高内涵细胞成像分析系统观察细胞凋亡染色图像显示,在8h组,我们可以看到少量的绿色的细胞膜以及红色的细胞核,而在12h组,我们能看到大量的红色的细胞核,说明细胞处于凋亡晚期或者坏死。4.活性氧含量检测试剂盒中,DCFH-DA作为一种荧光探针,能够间接性地检测细胞内活性氧含量的变化,本研究中我们持续监测了等离子体处理后24h中细胞内的DCF荧光强度。结果表明,等离子体处理后细胞内活性氧含量立即升高,是处理前的1.24倍,并缓慢持续增加,至20h时,细胞内活性氧(ROS)含量迅速提高至处理前的5.39倍,至24h时升高到处理前的13.88倍(p<0.05)。说明等离子体处理后活性氧(ROS)的产生也显示了一定的处理后经过的时间的相关性。5.等离子体处理以后,四种凋亡相关的基因,如Bid、Bcl-2,Caspase-3,Caspase-8被检测,qRT-PCR实验结果表明,等离子体处理后8h,随着等离子体处理剂量的提高(60s、90s、120s),基因Caspase-3的表达量分别是未处理组的2.57倍、2.85倍、3.70倍,而Caspase-8和Bid基因的表达量也是随着处理剂量的增加而增大。Bcl-2作为抗凋亡基因,其表达水平在90s抑制作用最强(p<0.05)。等离子体处理后12h组基因的表达与之相似,但Bid表达不再活跃。6.Western blot的实验结果表明,当等离子体处理后8h,剂量从60s增加到120s时,Cleaved Caspase 3,7,9和Cleaved PARP的表达量相比未处理的对照组逐渐提高,当处理12h后,剂量从60s增加到120s时,Cleaved Caspase 3,7,9和Cleaved PARP的表达量也是渐渐变大的,并且总的来说,12h组的表达量要强于8h组。研究结论低温等离子体能有效杀伤白血病细胞,凋亡是其主要的致死机制。本实验为低温等离子体技术对肿瘤治疗的临床应用提供了初步的实验依据。另外低温等离子体具有很好的特异性,在杀伤肿瘤细胞的同时对正常细胞几乎无损伤作用,该技术有可能成为一种治疗肿瘤的新方法。