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目的:恶性脑肿瘤是导致死亡的主要癌症之一。据统计,脑瘤是15岁以下儿童癌症死亡的第二大原因,是导致成年男性死亡的第三大癌症( 35～54岁年龄组为第四位) ;在15～34岁年龄组女性,癌症死亡的第四位是脑瘤。神经胶质瘤(Glioma)是颅内最常见的恶性肿瘤,大约占到全部原发性颅内肿瘤的40～50%, 70%以上的恶性胶质瘤患者在确诊后1年内死亡。可见,脑瘤特别是胶质瘤是高度致命的,其预后较差,给患者及其家庭造成重大灾难。因此,如何提高脑胶质瘤的治疗效果,是摆在我们每位医务工作者面前的艰巨任务。尽管现代医学特别是对癌症的诊断和治疗发展很快,许多先进的诊疗手段在临床上得到应用,然而对恶性脑肿瘤的治疗并没有突破性进展。当前,传统的手术切除,并辅助以放疗、化疗等手段依然是主要的治疗措施。近年来,随着肿瘤分子生物学研究的不断深入,在胶质瘤基因治疗方面取得了一定的进步,有些方法已经进入临床试验阶段或已应用于临床,有望为胶质瘤的治疗提供一条有效途径。白细胞介素24(Interleukin 24, IL-24),原名黑色素瘤分化相关基因-7(the melanoma differentiation associated gene, mda-7),是1995年Jiang H等人利用减数杂交技术,从β干扰素(Interferonβ, IFN-β)和蛋白激酶C激活剂MEZ诱导分化的人恶性黑色素瘤细胞HO-1中克隆的新基因,该基因在诱导分化的黑色素瘤细胞中高表达,并能促进黑色素瘤细胞分化,因此最初命名为MDA-7。根据其结构、染色体定位、碱基序列同源性及细胞因子样特性,MDA-7于2002年被正式命名为IL-24。研究表明,IL-24可以通过不同的方式抑制多种肿瘤细胞的增殖和诱导肿瘤细胞凋亡,而且IL-24具有抑制肿瘤血管形成,增强肿瘤细胞对放疗的敏感性等作用,新近的研究又发现IL-24可通过抑制相关基因的表达降低恶性肿瘤的侵袭和转移。本研究以大鼠C6胶质瘤细胞、C6/IL-24细胞、C6/pLXSN细胞为研究对象[1],观察外源性IL-24基因对大鼠C6胶质瘤细胞的抑制作用,并进一步检测细胞周期素cyclin B1、生存素(survivin)、p53、膜型基质金属蛋白酶1(MT1-MMP,MMP-14)mRNA和蛋白质的表达,以探讨IL-24抑制肿瘤增殖和侵袭的相关机制。方法1.细胞培养C6/IL-24、C6/pLXSN和C6细胞均以RPMI1640培养基培养,内含10%胎牛血清、青霉素100 U/ml、链霉素100μg/ml,置饱和湿度、37℃、5% CO2培养箱培养。2. MTT法检测细胞体外增殖活性对数生长期C6/IL-24、C6/pLXSN和C6细胞各200ul细胞悬液,1.5×104/ml细胞浓度接种于96孔培养板,37℃,5%CO2培养箱培养6天。每日检测细胞生长情况,每孔加入5mg/ml MTT 20μl,继续孵育4小时,离心吸去上清,每孔加入150μl DMSO。用酶标仪测490nm波长吸光值(A值),每孔设8个复孔,取其平均值并绘制细胞生长曲线。3.流式细胞术检测细胞周期和凋亡率将对数生长期的C6/IL-24、C6/pLXSN和C6细胞制成单细胞悬液, PBS冲洗2遍后70%酒精固定,用EB进行DNA定量荧光染色30 min后进行流式细胞分析。结果用DNA细胞周期分析软件ModFit LT 2.0计算G0/ G1、S、G2/M期分布百分比。4.体外肿瘤侵袭实验采用美国Corning公司生产的Transwell小室,按照说明书要求,将预置基质胶再水化后无菌条件下在Transwell小室下室中加入含10% FBS细胞培养液500μl,在上室中加入无血清培养基配制的C6/IL-24、C6/pLXSN、C6细胞悬液(1×105个细胞/ml) 300μl,5%CO2培养箱培养36 h。取出聚碳酸酯膜,擦去膜上面未侵入膜中的细胞,将膜放在载玻片上,甲醇固定,苏木精染色,普通光镜下计数穿过每张膜的细胞数。5. RT-PCR检测cyclin B1、survivin、p53和MT1– MMP mRNA的表达根据核苷酸序列用Premier 5.0软件设计cyclin B1、survivin、p53、MT1-MMP和β-actin引物。采用Trizol法提取C6/IL-24,C6/pLXSN和C6细胞总RNA,取2μg细胞总RNA逆转录成cDNA(37℃60 min, 95℃5 min)。取2μl逆转录产物进行PCR扩增。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳观察结果、照相,用凝胶图像分析系统分析结果,分别计算C6/IL-24细胞、C6/pLXSN细胞、C6细胞条带的积分光密度与相对应的β-actin条带积分光密度的比值。6. Western blotting检测C6/IL-24、C6/pLXSN和C6细胞中cyclin B1、survivin、p53和MT1-MMP蛋白的表达水平收集细胞→PBS洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE电泳→硝酸纤维素膜转移→5%脱脂奶粉封闭,室温1.5~2 h→结合一抗4°C过夜→TBS-T(含0.05% Tween-20的TBS)洗3次,5~10min/次→HRP-标记的羊抗鼠或羊抗兔IgG室温反应1~2h→TBS-T洗3次,5~10min/次→ECL显影,照相并用凝胶图像分析系统测定并计算各蛋白条带的积分光密度同对应的β-actin积分光密度比值。7.统计学方法实验结果以x±s表示,用SPSS 13.0统计软件作单因素方差分析(One-Way ANOVA),取P<0. 05为有显著性意义。结果1. MTT分析C6/IL-24细胞体外增殖情况C6/IL-24细胞在体外培养的生长与C6/pLXSN和亲代C6细胞相比,其吸光值降低,细胞生长曲线显示其体外增殖能力下降。2.流式细胞术检测细胞周期分布及凋亡率C6/IL-24细胞、C6/pLXSN细胞及亲代C6细胞的G0/G1期细胞比例分别为58.42±3.12%、49.04±3.14%及51.41±4.69%;S期细胞分别为14.51±1.23%、43.63±3.09%、42.25±2.45%;G2/M期细胞分别为27.07±2.17%、7.33±1.03%和6.34±1.05%。C6/IL-24细胞主要表现为G2/M期细胞增多,存在G2/M期阻滞(P<0.05),但C6/pLXSN细胞与亲代C6细胞比较无显著性差异(P>0.05)。C6/IL-24细胞2倍体峰前有明显凋亡峰,凋亡比例为15.46±1.78%,C6/pLXSN、C6细胞分别为4.37±0.51%和4.04±0.52%,无明显凋亡峰。C6/IL-24较C6/pLXSN、C6细胞凋亡比例高(P<0.05),C6/pLXSN、C6无明显差异(P>0.05)。3.体外肿瘤侵袭试验C6/IL-24细胞、C6/pLXSN细胞及C6细胞平均每个视野穿过聚碳酸酯膜的细胞数分别为8.31±0.88、14.65±1.08和15.08±1.18。C6/IL-24细胞穿过膜的细胞数量明显少于C6和C6/pLXSN细胞(P<0.05),C6/pLXSN与C6细胞穿过膜的细胞数无显著性差异(P>0.05)。4. RT-PCR检测C6/IL-24、C6/pLXSN及亲代C6细胞cyclin B1 mRNA的光密度比值分别为0.58±0.04、1.19±0.04和1.14±0.05;survivin mRNA为:0.91±0.05、1.39±0.05和1.44±0.04;p53 mRNA为:1.29±0.05、1.34±0.04和1.36±0.07;MT1-MMP mRNA分别为0.98±0.04、1.52±0.09和1.64±0.09。结果显示C6/IL-24细胞cyclin B1,survivin和MT1-MMP mRNA表达降低(P<0.05), C6/pLXSN细胞与亲代C6细胞比较无显著性差异(P>0.05)。C6/IL-24、C6/pLXSN及亲代C6细胞p53 mRNA的表达无明显差异(P>0.05)。5. Western blotting分析C6/IL-24、C6/pLXSN及亲代C6细胞cyclin B1蛋白IOD比值分别为0.49±0.04、0.65±0.05和0.70±0.03 ; survivin为0.14±0.02、0.40±0.04和0.42±0.05;p53为0.55±0.04、0.58±0.06和0.54±0.04;MT1-MMP为0.20±0.01、0.40±0.03和0.43±0.04。结果显示:与C6/pLXSN及C6细胞比较,C6/IL-24细胞的cyclin B1、survivin和MT1-MMP蛋白表达降低(P<0.05)。C6/pLXSN与C6细胞比较无显著性差异(P>0.05)。P53蛋白在三组细胞中的表达无明显差异(P>0.05)。结论:1外源性IL-24基因可抑制C6/IL-24细胞的增殖活性。2外源性IL-24基因对C6/IL-24细胞周期进程有抑制作用,使G2/M期细胞增加,细胞被阻滞于G2/M期。且这种阻滞效应可能与IL-24抑制细胞周期蛋白cyclin B1的表达有关。3 p53非依赖性下调survivin的表达是外源性IL-24基因诱导胶质瘤细胞增殖障碍和凋亡发生的重要因素。4外源性IL-24基因对C6/IL-24细胞的侵袭性有明显的抑制作用。对MT1-MMP表达的抑制是关键因素之一。