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研究背景目的：诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)是一类与胚胎干细胞（embryonic stem cells, ESC）高度相似的全能干细胞，2006年由日本科学家Yamanaka首次获得，由于其可避开伦理、免疫排斥等问题，干细胞再生与移植治疗领域中应用前景广泛。大量研究证明iPSCs可在体外分化成神经胶质细胞、神经元及神经干细胞（Neural Stem Cells，NSC）等，为脑卒中、脑外伤、帕金森（Parkinson’s disease，PD）、阿尔兹海默病(Alzheimer disease，AD)等中枢神经系统疾病的细胞移植治疗带来了可能。然而iPSCs向NSC分化的确切机制目前尚未明了。iPSCs与ESC具有相似的生物学特性，大量实验证实ESC的自我更新及分化受细胞外环境、Notch信号通路、Sirt1、miRNAs等多种因素的调控。Notch信号通路在干细胞的增殖、分化进程中均发挥着关键调控作用，Notch系统激活后干细胞增殖，而抑制Notch信号系统干细胞则分化加速；作为mir-34a下游靶基因的Sirt1对保证神经元的完整性及神经发育的顺利进行至关重要。本课题组通过实验证实“RA+无血清培养基”法可提高小鼠iPSCs向NSC定向分化效率；在此基础上通过加入Sirt1抑制剂烟酰胺（nicotinamide，NAM）抑制Sirt1的表达，应用实时定量PCR、Western blot、免疫荧光等方法检测神经分化过程中Notch信号、Sirt1、mir-34a及相关神经标志物的表达变化，初步探讨Sirt1、miRNAs及Notch信号分子等在iPSCs向NSC分化过程发挥的作用，为进一步阐明iPSCs向NSC定向分化的确切机制奠定基础。方法：1.饲养层细胞的制备：取E12.5d ICR小鼠胚胎，去头尾、四肢、内脏，消化成单细胞后培养，取P2-4代状态良好胚胎成纤维细胞（mouse embryonicfibroblast cells，MEF），10μg/ml的丝裂霉素C处理2.5h。2.小鼠iPSCs的培养及向NSC的诱导分化：采用RA+无血清培养基法诱导小鼠iPSCs向NSC分化，并利用免疫荧光染色鉴定分化细胞神经标志物（Nestin、SOX2、Tublin3及GFAP）的表达。3.采用实时定量PCR检测小鼠iPSCs向NSC分化过程各时间点Notch信号、Sirt1、mir-34a及Nestin等的表达变化。4.加入Sirt1抑制剂NAM，观察Sirt1在小鼠iPSCs向NSC诱导分化过程中的作用对及其Notch信号、mir-34a表达的影响，实验分为自然分化组、RA对照组、RA+NAM诱导组。免疫荧光染色鉴定神经标志物Nestin、SOX2、β-tubulinШ、GFAP蛋白的表达；实时定量PCR比较小鼠iPSCs向NSC分化过程各组Notch1、Sirt1、mir-34a、Nestin mRNA的表达；Western bolt检测各时间点Notch1、Sirt1蛋白的表达。结果：1.“无血清培养基+RA诱导法”可成功将小鼠iPSCs诱导分化为NSC。倒置荧光显微镜观察发现iPSCs经RA结合无血清培养基诱导，OCT4-GFP绿色荧光蛋白表达逐渐减少；倒置显微镜观察发现神经球贴壁培养过程不断有神经样细胞爬出，贴壁培养14天后细胞形成神经网状结构；免疫荧光染色显示细胞高表达Nestin、SOX2等神经干细胞标志物；NSC在无血清培养基中饲养2月，传至P10代仍保持良好状态。2.实时定量PCR结果显示：与iPSCs相比，在小鼠iPSCs向NSC分化过程中Notch1、Sirt1mRNA表达下调，后期NSC增殖过程表达上调；mir-34a及神经干标志物Nestin mRNA表达均持续显著上调。3.加入Sirt1抑制剂NAM后，神经球贴壁速度及其周围神经细胞爬出速率加快；免疫荧光染色显示NAM诱导组较自然分化组和RA组神经标志物Nestin、SOX2、β-tubullinIII及GFAP的表达增高；western blot及实时定量PCR检测发现加入NAM后Sirt1、Notch信号被抑制，使得iPSCs向NSC的分化速率提高，并促进iPSCs-NSC向终末神经细胞的分化。结论：1. RA结合无血清培养基诱导法能较高效率的诱导小鼠iPSCs定向分化为NSC；2.作为mir-34a下游靶基因的Sirt1可能通过影响Notch信号系统调控小鼠iPSCs定向分化为NSC；抑制Sirt1能促进iPSC向NSC分化，并促进iPSCs-NSC向终末神经细胞的分化。