论文部分内容阅读
MicroRNA (miRNA)是植物中广泛存在的、长度约20-25nt的内源单链非编码小分子RNA,在植物的生长发育、应对各种逆境胁迫等方面起着非常重要的调控作用。而目前关于大豆miRNA的研究还非常有限。为发掘逆境相关的miRNA,对大豆(Glycine max)幼苗进行了干旱、高盐、低温、脱落酸(ABA)和大豆花叶病毒(SMV)胁迫处理,提取你不同组织的小RNA后等量混合构建混合小RNA文库,用Solexa技术进行高通量测序,与生物信息学分析相结合,发掘与大豆逆境相关的miRNA,为大豆小RNA在抗逆研究方面提供有价值的信息。主要研究结果如下：1.在逆境胁迫条件下小分子RNA混合文库的Solexa测序共获得3201342条原始小分子RNA序列,经生物信息学分析筛选出338403条候选miRNA (?)序列,占原始序列的10.6%。共鉴定出包括60个已知miRNA家族的228个miRNA,64个新miRNA家族的76个miRNA。2.利用miRNA芯片筛选出22个逆境胁迫应答miRNA。其中,4个miRNA与高盐胁迫应答相关,miR156a、miR164、miR166a和miR2911;10个miRNA与干旱胁迫应答相关,niR164、 miR166a、miR168、482b-5p、miR2118、miR2911、miR1507b、miR1508a、miR319g和miR1450;8个miRNA与低温胁迫应答相关,miR156a、 miR164、miR166a、miR168、miR159a-3p、miR1508a、 miR1450和niR2911。3.受干旱胁迫的大豆miR2118至少有4类靶基因。Northern杂交结果显示,大豆miR2118受干旱胁迫诱导表达且表达有时空特异性。miR2118先在根中表达,后在茎和叶中高表达。在根中0.5小时被诱导表达,1小时表达量最高,表达呈先上调后下调,而茎和叶中表达呈上调趋势,而对高盐和低温胁迫无响应。通过5’RACE方法鉴定了miR2118在大豆中的4个功能各异的靶基因,包括一个编码未知功能蛋白的基因,3个分别编码LRR蛋白、信号肽酶Ⅰ和类基因沉默蛋白抑制子3的基因。4. miR1511与mR1511*共同切割同一靶基因。高通量测序数据分析及Northern杂交结果均证明了niR1511和miR1511的存在。5’RACE方法验证了niR1511的靶基因为一个属于60S核糖体蛋白L4家族(RPL4) Gmrpl4a (Glyma10g05580.1)基因,同时发现miR1511*也切割该靶基因,miR1511*的切割Gmrpl4a的第一个外显子,miR1511的切割Gmrpl4a的第二个外显子。5.研究结果显示miR1511有等位变异及地域分布特点。不同栽培大豆(Glycine max) MR1511序列是保守的；多年生野生大豆虽有多处Indel和SNP位点,但miR1511及miR1511*位点序列保守；而在一年生野生大豆(Glycine soja)中,存在4种不同的等位变异,其中两种由于片段缺失导致miR1511缺失,Northern杂交结果也验证了这种缺失现象,约1/4的一年生野生大豆不能加工形成miR1511。这些缺失种质主要集中分布在黄河中下游地区,说明MR1511基因的进化经历了自然选择。