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卵巢衰老是由多种生理及外界因素相互作用和逐渐积累的生物学现象,复杂的生理及外界因素造成卵泡数目不断下降是导致生理性和病理性卵巢衰老从而引起不孕症以及绝经的关键原因。据世界卫生组织预测,生育问题将成为世界上的第三重大疾病。卵巢衰老还可直接影响着生殖健康,引发绝经期提前以及心脑血管疾病、神经退行性疾病等慢性疾病的发生。然而卵巢功能除受下丘脑-垂体-卵巢轴调节外,也受体内外众多生长因子、细胞因子和激素等所构成的复杂调控网络调节,如卵巢卵泡的生长发育、退化以及类固醇甾体激素的合成等。近来大量研究表明转化生长因子-β(trans-forming growth factorβ,TGF-β)超家族的成员参与机体很多生理和病理过程的调控,其中TGF-β/Smad信号通路与卵巢卵泡发育密切相关。但目前有关TGF-β/Smad信号通路在生理性和病理性卵巢功能衰退中的关系研究尚未见有报道。本课题通过观察TGF-β/Smad信号通路的主要因子在生理性和病理性卵巢功能衰退中的表达和动态变化内在分子机制的探索已成为生殖医学研究的热点,为改善和延缓卵巢功能衰退,延迟生育力奠定基础。本课题采用阴道脱落细胞涂片筛选动情周期正常的3月龄(10只)和动情周期紊乱的>12月龄(5只)雌性SD(Sprague-Dawley)大鼠。随机分为对照组(C组,5只)、化疗组(H组,5只)和更年期组(G组,5只)。H组每只大鼠腹腔注射顺铂2mg/kg持续7d,C组和G组每只大鼠腹腔注射等体积的生理盐水持续7d,于大鼠动情后期称重、取血后统一麻醉处死取双侧卵巢组织并称量其湿重,计算各组卵巢指数,一部分进行固定以备石蜡切片,进行HE染色观察卵巢形态和窦状卵泡数变化进而评估各组卵巢功能情况,通过免疫组化方法检测TGF-β/Smad信号通路中各主要因子在各组卵巢组织蛋白表达情况;另一部分迅速冻存于液氮中,以备提取组织总RNA,通过实时荧光定量PCR法检测TGF-β/Smad信号通路中各主要因子在各组卵巢组织基因含量表达情况。根据各组卵巢脏器指数结果发现与C组相比,H组(P<0.05)、G组(P>0.05)卵巢脏器指数均下降;与G组相比,H组(P>0.05)卵巢脏器指数也下降。ELISA检查大鼠血清中E2和FSH的水平结果显示,与C组相比,H组、G组血清E2水平均降低(P<0.01),FSH水平均升高(P<0.01);与H组相比,G组血清E2水平均降低(P<0.05),FSH水平均升高(P<0.01)。卵巢组织石蜡切片HE染色结果显示各组卵巢结构存在差异。C组可见各级卵泡生长活跃,少量闭锁卵泡,在卵巢皮质中可见黄体。与C组相比,H组、G组大鼠生长卵泡数均明显减少,卵巢间质纤维结缔组织增生,卵巢中闭锁卵泡均显著增多,但G组较H组闭锁卵泡少,颗粒细胞层和黄体减少。同时卵泡计数结果分析显示C组、H组、G组生长卵泡数和黄体数逐渐递减,H组、G组明显少于C组(P<0.01);H组闭锁卵泡数高于C组(P<0.01)。TGF-β1/Smad信号通路中TGF-β1、TGF-βRI(TβRI)、Smad2(P-Smad2)、Smad3(P-Smad3)、Smad4、Smad7主要效因子在大鼠卵巢组织中均有表达,相关蛋白在卵泡颗粒细胞和卵母细胞胞质中可见阳性信号表达,在各级卵泡细胞中呈棕黄色阳性表达,其中Smad3、P-Smad3阳性表达也位于卵泡细胞胞核内。与C组相比,H组、G组大鼠卵巢中TGF-β1蛋白及m RNA的表达均明显降低(P<0.01),H组较G组降低但其差异无统计学意义。与C组相比,H组大鼠卵巢中TGF-βRI蛋白及m RNA的表达降低(P<0.05),G组较C组(P<0.05)、H组(P<0.01)均升高。与C组相比,H组大鼠卵巢中Smad2蛋白及m RNA的表达明显升高(P<0.01),G组降低但其差异无统计学意义,G组较H组蛋白升高(P<0.01),m RNA降低(P>0.05)。与C组相比,H组大鼠卵巢中Smad3蛋白及m RNA的表达明显降低(P<0.05),G组也降低但其差异无统计学意义,G组与H组蛋白相比无统计学意义。与C组相比,H组大鼠卵巢中Smad4蛋白及m RNA的表达明显降低(P<0.01)以及G组升高(P>0.05),G组较H组蛋白和m RNA升高(P<0.01)。与C组相比,H组大鼠卵巢中Smad7蛋白及m RNA的表达明显降低(P<0.05),G组较H组蛋白和m RNA升高(P<0.01)。与C组相比,H组P-Smad2、P-Smad3蛋白水平升高(P<0.05),G组P-Smad2蛋白水平降低(P<0.05),P-Smad3蛋白水平升高(P<0.05),而G组较H组P-Smad2蛋白水平降低(P<0.01),P-Smad3蛋白水平升高(P<0.01)。本实验结果表明化疗药物顺铂对卵巢产生损伤作用,导致卵巢组织结构和卵泡功能受损。生理性和病理性卵巢内分泌功能均降低,进而影响着卵巢功能的调节作用。TGF-β1/Smad主要效应分子在卵巢组织中广泛表达,并参与卵巢功能衰退的内在调控,与卵泡的生长、发育、凋亡相关。在卵巢功能衰退过程中,TGF-β1/Smad信号通路参与病理性卵巢功能衰退,主要通过下调TGF-β1/Smad3信号通路因子的表达,同时活化卵泡细胞质内Smad2表达。在生理性卵巢功能衰退中TGF-β1/Smad信号通路可能通过Smad7代偿性抑制通路调节有关。