脂肪与肥胖相关基因(fat mass and obesity-associated gene, FTO)是首个被发现与人类的非病理性肥胖相关的基因。肥胖通常被认为是一种脂肪组织的慢性炎症,肥胖个体体内异常分泌的一些内分泌、代谢及炎症因子是诱发Ⅱ型糖尿病和多种癌症的重要介质。在哺乳动物的研究中发现FTO直接或间接地与炎症反应标记物的表达以及Ⅱ型糖尿病等代谢疾病相关。提示,FTO可能作为炎症和代谢疾病之间的联系因子。然而,FTO在炎症反应中的表达及功能的研究还很少。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是革兰氏阴性菌的细胞壁成分,被广泛用于制作全身性炎症的研究模型。肝脏及下丘脑能够对LPS做出反应,发生一系列炎症和代谢的变化,调节机体的免疫功能及能量代谢平衡。在哺乳动物上的研究发现,FTO在巨噬细胞中有表达并受到LPS的影响。那么LPS是否能够影响肝脏及下丘脑中FTO的表达及其转录调控机制,都还未见报道。FTO是6N-甲基腺嘌呤(N6-methyl-adenosine, m6A)的去甲基化酶。研究发现,FTO能够通过影响一些基因mRNA上的甲基化水平,影响这些基因的表达。然而到目前为止,关于FTO作为去甲基化酶发挥功能的报道还很少,在禽类上仍是空白。FTO是否能够作为去甲基化酶,在LPS引起的肉鸡全身性炎症反应中发挥作用还未见报道。本文在肉鸡上应用LPS引起全身性炎症反应,研究FTO在肝脏及下丘脑中表达的变化、其转录调控机制,以及可能的功能。1 LPS对肉鸡肝脏及下丘脑中FTO表达的影响取广州温氏土鸡种蛋150枚,按照标准孵化程序孵化。出雏后第28天,采取腹腔注射的方式,试验组注射0.5 mg/kg体重剂量的LPS,对照组注射相同体积的生理盐水。注射后2h及24 h采集肝脏、下丘脑及抗凝血,分离血浆。LPS处理后1小时实验组动物即出现精神萎靡、饮水和进食频率下降的症状。LPS注射后2h,肝脏中TLR2 (Toll-like receptor).4.7及TLR21的mRNA表达均显著降低(P<0.05),而这些基因在下丘脑中的表达均未受到影响。LPS注射24 h后,肝脏中TLR2、4及TLR5的mRNA表达均显著降低(P<0.05),而TLR2在下丘脑中的表达相对于对照组却显著升高(P<0.01),其他TLRs的表达依然没有变化。LPS注射2h后,肝脏中促炎细胞因子IL(interleukin)-1β、IL-6、IL-8、IL-12、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase, iNOS)以及抗炎细胞因子IL-10和转化生长因子P (transforming growth factor-p, TGFp)的基因表达均显著升高(P<0.01)。而在下丘脑,只有IL-1β、IL-8以及TGFP的表达受到了LPS注射的影响,其中IL-1β(P<0.01)和IL-8(P<0.05)的表达显著升高,而TGFβ的表达显著降低(P<0.01)。LPS处理24 h后,在肝脏中检测的细胞因子,只有IL-1β和iNOS的表达受到影响,其中前者显著升高(P<0.05),而后者则显著降低(P<0.01)。在下丘脑中只有TGFβ的表达相比与对照组显著升高,其他检测到的细胞因子表达相对于对照组则没有差异。LPS腹腔注射后2h及24 h,肉鸡的肝体比均显著升高(P<0.05)；注射后24 h肝脏中甘油三酯的含量显著升高(P<0.05)；注射后2 h血浆中的甘油三酯(P=0.09)以及注射后24h血浆中的总胆固醇(P=0.09)含量都有上升的趋势；血浆中的葡萄糖水平在注射后2h显著升高(P<0.01)。肝脏中糖脂代谢相关的基因表达也受到影响,其中包括脂肪酸代谢相关基因肉碱棕榈酰转移酶(carnitine palmitoyl transferase, CPT1) (P<0.05)、固醇调节元件结合蛋白1 (sterol regulator element binding protein 1, SREBP1) (P<0.01),胆固醇代谢相关基因胆固醇-7α羟化酶(cholesterol-7 alpha-hydroxylase, CYP7A1) (P<0.01)、法尼酯X受体(farnesoid X receptor, FXR) (P<0.01)、低密度脂蛋白胆固醇受体(low density lipoprotein receptor, LDLR)(P<0.05)以及糖异生相关基因糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor, GR) (P<0.05)和果糖-1,6-二磷酸酶(fructose-1,6-bisphosphatase, FBP1) (P<0.05)。除FXR的基因表达显著上升外,其他基因的表达均显著降低,且这些差异均发生在LPS注射后2 h。LPS主射后24 h,所检测的所有糖脂代谢相关基因的表达相对于对照组均没有差异。检测两个组织FTO的基因表达发现,LPS注射后2h及24 h,肝脏中FTO的基因表达均显著降低(P<0.05),而下丘脑中FTO的表达则未受到影响。本部分结果提示,本文所采用的LPS注射剂量及注射方式引起了肉鸡全身性炎症反应,下丘脑和肝脏炎症相关基因表达对LPS处理的应答模式不同,提示炎症反应具有组织差异。肉鸡肝脏的糖脂代谢受到影响,而FTO的表达变化呈现出组织特异性。2 LPS影响肉鸡肝脏中FTO表达的转录调控我们在前面的实验发现,LPS腹腔注射能够降低肝脏FTO的基因表达,而对下丘脑中FTO的表达没有影响。在大鼠上的研究发现,Leptin能够通过STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3)通路降低FTO在下丘脑中的表达。在炎症反应中,STAT3能够受到细胞因子,尤其是IL-6的激活,发挥重要的转录调控作用。本实验假设,LPS引起的FTO在肝脏及下丘脑中的表达差异,可能是通过STAT3的调控产生的。实验首先预测了鸡FTO启动子上STAT3的可能结合位点。发现,在FTO基因翻译起始位点之前3000 bp的侧翼序列中有1个STAT3的可能结合位点。STAT3的基因及蛋白表达分析显示,LPS注射后2 h,肝脏中STAT3的基因表达显著升高(P<0.05),磷酸化STAT3 (p-STAT3)与总STAT3的比值也显著升高(P<0.01)。而下丘脑中的STAT3的基因及蛋白表达都未受到影响。然而,应用染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation, ChIP)并没有发现STAT3结合到肝脏FTO启动子上。在FTO的启动子上,我们还预测到9个C/EBPβ (CCAAT/enhancer binding proteinβ)的可能结合位点。以往的报道发现,C/EBPP能够与STAT3互作调控基因的表达,而C/EBPβ也是炎症反应中重要的转录因子。本实验中并没有发现LPS能够影响肝脏及下丘脑中C/EBPβ的基因和蛋白的表达。但ChIP实验发现,LPS能够显著增加结合在FTO启动子上的C/EBPβ的水平(P<0.05)。应用免疫共沉淀技术,发现肝脏中C/EBPβ与STAT3确实存在蛋白间的互作。结果提示,LPS引起FTO在肝脏中的基因表达下降可能是受到了转录因子C/EBPβ的调控。而STAT3可能通过与C/EBPβ以蛋白互作的形式参与到了FTO基因表达的调控。3 LPS处理对FTO相关基因转录本m6A修饰的影响我们在相关性分析中发现,LPS处理后2h肉鸡的肝脏中,FTO同时与炎症和代谢相关基因的表达显著相关,其中包括Toll样受体中的TLR2 (P=0.01).4 (P=0.011)及TLR21 (P<0.05),且FTO的表达与这三个基因的表达都呈现显著的正相关。检测的细胞因子中IL-6 (P<0.01)、IL-8 (P<0.01)以及iNOS (P<0.05)的基因表达与FTO呈现显著的负相关。在代谢相关的基因中,脂代谢相关的基因CPT1(P<0.01)以及LDLR (P<0.05),糖异生相关的基因GR (P<0.01)、FBP (P<0.01)以及PCX (P<0.05)的表达与FTO呈显著的正相关。FTO是m6A (N6-methyl-asenosine)的去甲基化酶。应用m6A免疫杂交,我们并没有发现LPS注射后肉鸡肝脏中总m6A水平的变化。但是,应用m6A免疫共沉淀技术,我们发现使用m6A特异性抗体进行免疫沉淀,LPS处理组的免疫沉淀RNA回收率相对与对照组有上升的趋势(P=0.064)。说明,LPS处理后肉鸡肝脏RNA的m6A水平显著升高。这一结果不同于前面使用m6A免疫杂交技术的结果,可能是由于实验方法的不同分辨率导致的。进一步,我们检测了与FTO表达显著相关的基因的m6A水平。首先,对比这些基因在小鼠上的研究中是否含有m6A修饰。我们发现,炎症相关基因TLR2及TLR4,脂代谢相关基因CPT1及LDLR的基因上均含有m6A修饰。同时在我们的结果中与FTO表达没有显著相关性的基因中,SREBP2、HMGCR基因上也含有m6A修饰。而我们关注的重要的转录因子C/EBPβ基因的3’UTR上也存在一个m6A修饰位点。根据在哺乳动物上发现m6A偏向于分布在编码开始和结束位点附近的规律,我们分别在鸡上这些基因的编码区起始及结束位置附近设计引物,应用m6A免疫共沉淀结合qPCR技术,检测这些区段内m6A的相对水平是否受到了LPS的影响。结果显示,LPS处理后2h,肉鸡肝脏CPT1基因编码区开始位置附近的m6A水平相比于对照组显著减低(P<0.01)。而该基因编码结束位置附近的m6A水平并没有受到影响。C/EBPβ基因编码区结束位置附近的m6A水平也没有受到影响。我们同时检测与FTO表达具有显著相关性的基因,GR以及FBP1的m6A水平。结果显示,GR与FBP1基因编码区开始位置附近的m6A水平并没有受到LPS的影响,而FBP1基因编码区结束位置附近的m6A水平在LPS注射组显著低于对照组(P=0.06)。以往的研究发现,基因编码区起始点附近的m6A与基因的表达呈正相关。与之相符,我们在第一部分结果中发现CPT1基因在LPS处理后2h肝脏中的表达显著降低,而其编码区起始位点附近的m6A也显著降低。而目前为止,基因编码区结束位置附近的m6A水平与基因表达的关系还不清楚。我们的结果显示,LPS注射后2h肉鸡肝脏中FTO的表达与炎症及代谢相关的某些基因存在显著相关性,其中CPT1基因编码区起始位置附近的m6A水平的改变可能与肉鸡肝脏脂代谢相关基因CPT1表达显著降低有关,而FBP1基因的表达下降也有可能受到其mRNA上m6A的水平的影响。FTO作为m6A的去甲基化酶,可能调控了这些基因m6A水平,进而影响其基因的表达。综上所述：本文发现在LPS引起的肉鸡全身性炎症反应中,FTO在肝脏及下丘脑中存在表达变化的特异性；转录因子C/EBPβ和STAT3可能受到IL-6的刺激,参与FTO的表达调控；同时FTO可能作为肝脏中炎症及代谢反应的连接分子,其表达变化可能会影响肝脏基因的m6A水平,其中CPT1及FBP1基因m6A水平的降低可能影响其基因的表达,进而影响肝脏在LPS引起的炎症反应中的脂肪酸氧化和糖异生过程。