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研究背景:心力衰竭是我国严重的公共卫生问题。有氧运动干预对预防心力衰竭和延缓心衰进程均大有作为,但目前机制并不十分明确。在前期工作中,我们采用腹主动脉缩窄术获得了心衰大鼠模型,并对其进行为期8周的有氧运动干预。结果显示,有氧运动改变了心肌细胞的miRNA表达谱,并增强了线粒体功能。我们认为,miRNAs表达变化调节了心脏功能相关的靶基因表达,逆转线粒体功能障碍和结构异常,从而延缓心衰进程。在这个过程中,细胞质定位的miRNA和线粒体定位的miRNA起到了通力合作的作用。但线粒体定位的miRNA(mitomiR)的研究目前开展得并不多,其在大鼠心肌中的表达谱并不明确,且有氧运动可以改变miRNA的定位。为了研究有氧运动干预心力衰竭过程中mitomiR的作用,我们分离了不同处理组大鼠左心室心肌的超纯线粒体,提取线粒体RNA进行高通量测序。测序结果显示,有氧运动对mitomiR表达谱变化具有显著效应。其中,除了一些已知的miRNAs发生了表达水平的变化或定位的变化,我们还得到了412个首次发现的定位于线粒体内的核酸序列。采用生物信息学方法对这412个核酸序列进行二级结构拟合,得到44条符合miRNA二级结构的序列。我们认为,其中必定有一些是首次发现的mitomiR,其在有氧运动干预心力衰竭的过程中起到重要作用。研究目的:对前期工作筛选出的44条符合miRNA二级结构的候选miRNA序列进行验证,确定新的mitomiR的存在。寻找新的mitomiR的候选靶基因,探索该mitomiR对线粒体生物合成及功能恢复的调控方式,进而讨论其在有氧运动缓解和治疗心衰过程中的地位,为心力衰竭的康复与治疗提供理论依据和可能的干预靶点。研究方法:1.引物的设计:miRNA引物与普通mRNA引物略有不同,需要设计特定的逆转录引物延长cDNA的序列长度,以满足后续实验需求。因此本实验所需的所有miRNA引物均根据microRNA RT-PCR引物设计方法进行设计。2.mitomiR的验证:Trizol法提取总RNA,以RT-qPCR验证筛选出的候选miRNA序列是否在细胞中存在转录本。3.候选靶基因的验证:以EGFP荧光报告系统为手段(在EGFP表达质粒的3′UTR区插入候选靶基因的mitomiR结合片段,检测EGFP的表达水平)来判断mitomiR对候选靶基因表达的调控。用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pcDNA-EGFP载体以构建预测靶位点的重组质粒,用PmeⅠ和XbaⅠ分步酶切pcDNA3-U6M2载体以构建mitomiR-207表达质粒。在H9C2心肌细胞中过表达pcDNA3-U6M2-mitomiR-207重组质粒,以转染空载体作对照,确定pcDNA3-U6M2-mitomiR-207的转染效率;在HEK-293T人胚肾上皮细胞中共转染pcDNA3-U6M2-mitomiR-207、pcDNA3-靶基因序列-EGFP重组质粒和psD-Red-N1质粒,以验证mitomiR-207是否调节候选靶基因的表达。结果:1.对前期实验中筛选出的44个候选miRNA序列,经序列比对及生物信息学分析,精简为26条序列。对该26条候选miRNA序列进行RT-qPCR验证,其中有15条序列可以获得扩增。2.对筛选出的15条序列的PCR产物进行测序,有9条序列的扩增产物的测序结果与前期深度测序的结果一致,暂定为新的mitomiR。它们是:novel miRNA-6、novel miRNA-50、novel miRNA-64、novel miRNA-98、novel miRNA-115、novel miRNA-207、novel miRNA-275、novel miRNA-291、novel miRNA-3053.我们选取其中表达水平较高且受有氧运动干预变化最大的一条mitomiR进行进一步研究,即上述9条中的novel miRNA-207,并定名为mitomiR-207。结果显示,mitomiR-207为双定位miRNA,既定位于线粒体中调控线粒体基因组的表达,也在胞质中调控核编码基因的表达。4.经生物信息学预测,mitomiR-207在大鼠线粒体全基因组上有13个可能的结合位点,为可能的调节靶点。结合位点分布在ND4、ND5、ND6、COX1、COX3、Trnd、Trnk(3个结合位点)、RNr-2、RNr-1(2个结合位点)的基因。5.EGFP荧光报告系统结果初步显示,mitomiR-207至少可以上调线粒体基因ND4、ND6的表达。结论:mitomiR-207是我们新发现的一条miRNA,它既定位在细胞质中,也可以定位到线粒体内。在有氧运动干预心衰的进程中,mitomiR-207在线粒体中高表达,上调线粒体基因ND4和ND6的表达水平。