猪链球菌血清2型（Streptococcus suis serotype2）是一种重要的人畜共患病病原体，猪链球菌感染具有较高的病死和病残率，其最主要的临床症状是脑膜炎，与其它细菌性脑膜炎相似，我们认为猪链球菌致脑膜炎的过程也是多步骤的，其中最关键的步骤是猪链球菌如何穿过血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）进入中枢神经系统。BBB是重要的结构和功能屏障，在维护中枢神经系统（CNS）免受血液中的有害物质和微生物的侵入方面起重要作用，其主要由脑微血管内皮细胞（BMEC）、星形胶质细胞和周细胞组成，而脑微血管内皮细胞是其最主要的组成部分。因此，猪链球菌与脑微血管内皮细胞相互作用的研究对揭示猪链球菌穿过BBB的作用机制，进而研究猪链球菌致脑膜炎的机制均有重要意义。我们课题组在前期工作中，利用人脑微血管内皮细胞（hCMEC/D3），这一国内外公认的模拟BBB较好的细胞系，建立了人BBB体外模型，并确认了猪链球菌以细胞旁的途径穿过BBB。本研究旨在利用建立的人BBB体外模型，筛选可能影响猪链球菌穿BBB能力的毒力因子，并研究分析其作用机制。本研究筛选了本课题组前期发现的多个可能毒力基因如SSU05₁000，SSU05_MRP，SSU05₁815及SSU05₁664等在猪链球菌穿血脑屏障过程中的作用。实验结果表明，敲除SSU05₁000，SSU05_MRP基因后，猪链球菌穿BBB能力显著下降，而敲除其它毒力基因对猪链球菌穿BBB能力无显著影响。因此，我们推测SSU05₁000，SSU05_MRP很可能在猪链球菌穿BBB过程中发挥重要作用。SSU05₁000是本课题组新发现的细胞壁蛋白，具有较强的免疫原性。本课题组前期动物实验结果表明：SSU05₁000有助于猪链球菌抵抗免疫细胞的杀伤，从而实现血中存活，有助于细菌进入脑部。但是，具体的作用机制并不清楚，且目前尚未有对该蛋白的研究报道。为了研究SSU05₁000在猪链球菌穿BBB过程中作用机制，本研究对该基因进行了重组表达和纯化。首先，构建pET30a-SSU05₁000重组表达质粒，并将其转入表达菌株大肠杆菌BL21（DE3）中。IPTG诱导后，SDS-PAGE电泳显示该蛋白为在细菌裂解液上清中，为可溶性表达，然后利用镍亲和层析法对该蛋白进行纯化，得到纯度90%以上的重组SSU05₁000蛋白，并用TritonX-114去除污染的脂多糖（LPS）。为了验证SSU05₁000基因在猪链球菌穿血脑屏障过程中的作用，将获得的重组蛋白预处理hCMEC/D3细胞，然后评价05ZYH33△1000的穿过能力。结果表明：SSU05₁000蛋白可以使05ZYH33△1000穿膜能力恢复到05ZYH33野生株水平。为了分析猪链球菌穿血脑屏障过程中激活的信号通路，本研究筛选了多种信号通路的抑制剂。研究结果表明：p38MAPK和JNK通路抑制剂预处理hCMEC/D3细胞后，能显著降低猪链球菌穿血脑屏障能力。提示：猪链球菌在穿血脑屏障过程中可能需要激活MAPK信号通路。在此基础上，本研究进一步研究了SSU05₁000蛋白与MAPK信号通路激活之间的关系。Western blot检测结果显示SSU05₁000可以激活p38，JNK信号通路。综上所述，本研究结果提示SSU05₁000通过激活p38, JNK信号通路从而破坏BBB的完整性，打开细胞间隙，有助于猪链球菌穿过BBB。