油橄榄(Oleaeuropaea L.)为木犀科(Oleaceae)木犀榄属(Olea)常绿乔木,原产于小亚细亚,是世界上著名的四大木本油料作物之一。经油橄榄果实榨取的橄榄油被誉为“植物油皇后”和“液体黄金”,其中富含不饱和脂肪酸和大量生物活性物质,使其具有极高的营养价值,是当前世界上所公认的最健康的食用油之一。乙烯是一种极其重要的气体植物激素,影响植物花朵和果实的衰老和脱落,响应植物受到的逆境胁迫等,在植物的生命周期中发挥着重要的生理功能。因此,乙烯严重影响油橄榄果实的品质和产量,进而影响油橄榄的营养价值和经济价值。目前,高等植物乙烯生物合成途径己研究得比较清楚,ACC合成酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase,ACS)和 ACC 氧化酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase,ACO)是植物乙烯合成途径中 2 个关键酶,直接影响着植物内源乙烯的产量。本研究采用反转录PCR技术(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)、末端快速扩增技术(Rapid amplification of cDNA end,RACE)、DNA Walking 技术融合引物嵌套 PCR(Fusion primer and nested integrated PCR,FPNI-PCR)以及一个油橄榄转录组数据库等分子生物学技术和数据库,分别从油橄榄果实DNA和总RNA中克隆扩增出1个油橄榄ACS基因的DNA和cDNA序列,3个油橄榄ACO基因的DNA和cDNA序列,并对其进行了相关的生物信息学分析,这4个基因分别命名为OeACS、OeACO1、OeACO2和OeACO3。为了进一步验证OeACO1、OeACO2和OeAC03的生物学功能,对克隆扩增得到的3个OeACO基因在大肠杆菌BL21(DE3)进行了异源表达,并对重组蛋白的酶活性进行了分析。得到了如下主要研究成果:1.OeACS基因的DNA长度为1882bp,cDNA长度为1423bp,含有4个外显子和3个内含子,开放阅读框编码423个氨基酸。生物信息学分析表明,该OeACS编码蛋白的理论分子质量为47871.55,等点电为6.32,分子式为C2125H3339N583O638S19,属于不稳定蛋白,无信号肽和跨膜区域。该OeACS蛋白二级结构含42.08%的α-螺旋,11.82%的β-转角和26.24%的不规则卷曲;多肽链中具有高度保守序列IQMGLAENQ和VYSLSKDLGLPGFRVG;多肽链中的N185、Y216和D213能与PLP上的N1和吡啶环上的03’形成氢键,Y128能够稳定PLP的吡啶环,K252则是PLP的结合位点,与PLP反应形成希夫碱;蛋白活性部位的Y128、A103、T104、S249、S251和R260参与酶促反应,使SAM形成ACC。2.3个OeACO基因的DNA序列长度分别为1463bp,1481bp和1414bp,cDNA长度分别为1169bp,1150bp和1155bp,均含有4个外显子和3个内含子,其中OeACO1的开放阅读框长954bp,OeACO2的长951bp,OeACO3的长954bp,分别编码317,316和317个氨基酸,同源比对表明这3个基因的ORF部分序列相似度很高,达到90%以上。生物信息学分析表明,OeACO1蛋白的二级结构由45.11%的α-螺旋,11.36%的β-转角,24.92%的不规则卷曲组成,理论分子质量为36051.3,等电点为5.34,分子式为C1610H2510N422O479S19,属于稳定蛋白;OeACO2 蛋白中α-螺旋占 45.89%,β-转角占 11.08%,不规则卷曲占25.63%,理论分子质量为35859.1,等电点为5.48,分子式为C1611H2514N422O474S15,属于稳定蛋白;OeACO3蛋白则由45.74%的α-螺旋,11.67%的β-转角,24.92%的不规则卷曲组成,理论分子质量为36067.4,等电点为5.54,分子式为C1618H2530N424O477S16,属于稳定蛋白。这3个蛋白均不含信号肽和跨膜区,均具有Fe2+的结合位点H177、D179和H234以及底物ACC羧基的结合位点R244。3.将3个OeACO基因的ORF部分成功构建到表达载体pET30b(+)上,并转入大肠杆菌BL21(DE3)中成功实现了原核诱导表达,SDS-PAGE电泳检测表明这3个重组蛋白的分子量均约为40kDa,与预期相符;利用气质联用仪GC-MS对重组蛋白的酶活性检测显示OeACO1、OeACO2和OeACO3的酶活大小分别为10.94U、13.15U和16.03U,表明重组表达的酶蛋白具有植物ACO酶活性。