无论是药物代谢酶还是药物作用受体，其本质均为蛋白质，蛋白质的功能是由其空间结构决定的。药物代谢酶、转运体等存在着基因多态性与药物疗效和毒性的相关性问题，因而可以认为药效及毒性的个体间遗传差异都是由各种cSNPs经转录翻译产物的结构差异造成的。N-乙酰化酶2(NAT2)表达于人体的肝脏和肠道，在体内参与20多种肼类化合物及致癌性芳香胺和杂环胺类化合物的生物激活或灭活代谢，同时与某些癌症的遗传易感性有关。因此，近年来NAT2在药物代谢方面的作用正受到越来越多的重视。本课题的目的是建立快速、准确检测NAT2基因多态性的方法，研究中国人NAT2基因型的分布，借助计算机模拟技术获得NAT2的三维模型，通过结构分析，研究相关功能，探索其基因多态性对结构和功能的影响，进一步从分子水平解释基因多态性造成药物代谢的个体差异，有助于进行相关药物的设计，指导临床合理使用相关药物。 第一部分：两步PCR-RFLP法检测中国人N-乙酰化酶基因型 中国人群中NAT2的基因型主要有野生型(*4)、突变型(*5、*6、*7)，NAT2的代谢类型主要分为快代谢(EM)和慢代谢(PM)，慢代谢主要与*5、*6、*7三种等位基因有关。本部分主要是建立一种新的快速方便的PCR-RFLP法检测NAT2的多态性，并研究NAT2基因型在中国人群中的分布频率。对来自十八个省市的150名中国健康人NAT2基因类型进行分析，用改进的酚/氯仿抽提法提取细胞中的DNA，经PCR扩增NAT2全长后，在一定的反应体系中分两步加入内切酶KpnⅠ、BamHⅠ和TaqⅠ，得到的片段以电泳检查结果，同时用等位基因特异扩增法(ASA)方法检测其中20％的样本，用Hardy-Weinberg平衡计算NAT2基因型的分布频率。结果显示两步PCR-RFLP法与ASA法结果完全一致。中国人野生型*4和*5、*6、*7三种突变型等位基因的基因频率分别为63％、4.3％、18.3％和14.3％，符合Hardy-Weinberg平衡(x2=7.89，v=9，0.7＞P＞0.5)。本试验通过对原有PCR-RFLP法进行改进，达到快速、简便地检测NAT2基因型的目的，并且与等位基因特异性扩增法的检测结果一致，能准确地预测中国人NAT2慢代谢，可以用于临床检测。 第二部分：N-乙酰化酶的结构模拟、功能分析和其基因多态性对活性的影响 在已知用X射线衍射法得到SalmonellatyphimuriumNAT(StNAT)晶体结构的基础上，对人类NAT1、NAT2和StNAT的氨基酸序列进行多重序列比对，二级结构预测，折叠识别，并采用同源模拟SWISS-MODEL服务器，以StNAT为模板，对人类NAT2(residues29±131)进行同源结构模拟，用Swiss-PdbViewer对结构进行进一步的分析，将模板蛋白和目标蛋白的结构进行比对，重点分析活性位点及相关部分，与模板蛋白结构比较的同时根据结构特征对其功能进行分析，并对其蛋白功能的结构基础以及活性位点进行研究。在此基础上对NAT2基因突变(G191→A)引起的氨基酸突变(Arg64→Gln)，进行模拟分析，研究突变造成原子的角度和距离等结构的变化，探索其引起催化活性变化的机制，从分子水平解释基因多态性造成药物代谢的个体差异。同源模拟的结构模型用PROCHECK进行评价。结合以上结果，对NAT2的催化结构域、活性位点、构象稳定性进行分析，预测其如何进行底物的选择和乙酰化过程。结果表明，NAT2催化功能必要条件的高度保守的半胱氨酸残基(与Cys68对应)，高度保守的残基Arg64对NAT2的构象稳定性有贡献，对应于NAT2结构中(Cys68,His107,Asp122)三个关键残基作为类半胱氨酸蛋白酶催化三元组联合发挥催化作用，比较stNAT和NAT2活性部位的结构元件发现，二者均含有参与催化中心构成的环状结构。既往研究显示，该环状结构中的某些氨基酸残基参与结合辅酶A及对芳香胺底物的选择性。这些残基包括125位氨基酸(NAT2中125位丝氨酸)，该氨基酸被认为参与对底物的识别过程，从NAT2的结构分析得到了对上述结论直观和合理的解释。评价结果表明同源模拟建立的NAT2结构合理，可以作为功能分析以及解释相关问题的依据。