目的:　　肺癌是目前全球最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率居肿瘤首位，并有逐年上升的趋势，转移是造成肺癌患者死亡的主要原因。肺癌的转移机制十分复杂，是一个多基因、多步骤、多阶段的生物学过程，其中涉及到多种癌基因的激活及抑癌基因的失活。因此，深入研究肺癌的发生、发展、侵袭及转移的分子机制具有非常重要的意义。　　DAL-1(Differentially expressed in Adenocarcinoma of the Lung)是一个抑癌基因，我们前期工作已证明其能明显抑制肺癌细胞的生长、侵袭和转移。双向电泳结合质谱分析鉴定证明ANXA1是DAL-1相关蛋白，在肺癌组织中呈现高表达，与肿瘤增殖和转移有关；利用生物信息学技术结合转移相关基因芯片分析筛选出miR-26a对DAL-1有调控作用，并证明了miR-26a在肺癌组织中发挥抑癌基因的作用，具有抑制肺癌细胞侵袭和迁移的功能。有研究报道，ANXA1可激活NF-κB通路促进乳腺癌细胞的侵袭和转移；在心肌成纤维细胞和软骨细胞中p65可负向调控miR-26a的表达，由此提示ANXA1促进肺癌转移的作用可能部分是通过ANXA1-NF-κB-miR-26a调控通路得以实现的。本研究拟对此假设加以证明，从而为进一步阐明肺癌转移机制补充新的内容，为寻找肺癌转移标志物和潜在治疗靶点提供理论依据。　　方法:　　一、非小细胞肺癌中ANXA1表达水平的检测　　1、利用免疫印迹(western blot)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测在非小细胞肺癌癌组织、配对癌旁组织中ANXA1的表达情况。　　2、利用western blot和qRT-PCR方法检测非小细胞肺癌细胞株中ANXA1的表达情况。　　二、ANXA1对非小细胞肺癌生物学行为的影响　　1、建立稳定干扰ANXA1的非小细胞肺癌细胞株：将干扰ANXA1慢病毒载体分别感染A549和H1299细胞株，实验分六组：LV-ANXA1-RNAi（实验组）、LV-ANXA1-RNAi-con（空载体组）、A549（空白对照组）和H1299（空白对照组）。将干扰ANXA1的慢病毒(LV-ANXA1-RNAi)分别感染A549和H1299细胞后，通过96孔板有限稀释法挑选阳性单克隆细胞，命名为ANXA1 siRNA，通过western blot方法鉴定稳定干扰ANXA1细胞株的建立。　　2、建立干扰后再过表达ANXA1的非小细胞肺癌细胞株：实验分三组：LV-ANXA1（实验组）、LV-ANXA1-con（空载体组）和A549-ANXA1 siRNA（空白对照组）。将过表达ANXA1的慢病毒载体(LV-ANXA1)感染A549-ANXA1 siRNA细胞，通过96孔板有限稀释法挑选阳性单克隆细胞，命名为A549-si-ANXA1/ANXA1，通过western blot方法鉴定过表达ANXA1细胞株的建立。　　3、利用CCK-8细胞增殖、细胞划痕及Transwell和Boyden实验检测稳定干扰和过表达ANXA1后对非小细胞肺癌细胞生长、侵袭及迁移的影响。　　三、p65对miR-26a表达调控的研究　　1、通过western blot和qRT-PCR方法检测非小细胞肺癌癌组织、配对癌旁组织中p65的表达情况。　　2、抑制A549细胞中p65活性对miR-26a表达的影响：实验分为三组：A549-SN50（实验组）、A549-DMSO（实验对照组）及A549（空白对照组）。利用核浆蛋白分离试剂盒分离胞浆和胞核蛋白及western blot方法检测胞浆中总p65和胞核中P-p65的表达，qRT-PCR检测miR-26a的表达情况。　　3、抑制干扰后再过表达ANXA1细胞中p65活性对miR-26a表达的影响：实验分为三组：A549-si-ANXA1/ANXA1-SN50（实验组）、A549-si-ANXA1/ANXA1-DMSO（实验对照组）和干扰后再过表达ANXA1(A549-si-ANXA1/ANXA1)（空白对照组）。利用核浆蛋白分离及western blot方法检测胞浆中总p65和胞核中P-p65的表达，qRT-PCR检测miR-26a的表达情　　况。　　四、ANXA1-NF-κB-miR-26a通路对非小细胞肺癌细胞侵袭和迁移能力的影响　　1、ANXA1对NF-κB通路的调节作用　　1）干扰ANXA1表达对NF-κB信号通路分子表达的影响：实验分为三组：A549-ANXA1 siRNA（实验组）、A549-ANXA1 siRNA-con（空载体组）和A549（空白对照组）。利用核浆蛋白分离和western blot方法检测干扰ANXA1细胞中IKKα/β、IKKγ、IKBα、p65和P-IKKα/β、P-IKKγ、P-IKBα、P-p65的表达变化。　　2）干扰后再过表达ANXA1对NF-κB信号通路分子表达的影响：实验分为三组：A549-si-ANXA1/ANXA1（实验组）、A549-si-ANXA1/ANXA1-con（空载体组）和ANXA1 siRNA（空白对照组）。利用核浆蛋白分离和western blot方法检测过表达ANXA1细胞中IKKα/β、IKKγ、IKBα、p65和P-IKKα/β、P-IKKγ、P-IKBα、P-p65的表达变化。　　2、ANXA1是否通过调节NF-κB/IKKγ影响miR-26a的表达及生物学行为的影响　　1）通过qRT-PCR方法检测干扰和过表达ANXA1细胞中miR-26a的表达情况。　　2）利用Pearson相关性分析7种非小细胞肺癌细胞株中ANXA1、p65及miR-26a的表达相关性。　　3）A549细胞中IKKγ在ANXA1调控miR-26a表达中的作用：实验分为三组：A549-IKK-16（IKKγ抑制剂）（实验组）、A549-DMSO（实验对照组）和A549（空白对照组）。利用western blot方法检测细胞中IKKγ和P-IKKγ的表达， qRT-PCR方法检测miR-26a的表达情况。　　4）干扰后再过表达ANXA1细胞中IKKγ在ANXA1调控miR-26a表达中的作用：实验分为三组：A549-si-ANXA1/ANXA1-IKK-16（IKKγ抑制剂）（实验组）、A549-si-ANXA1/ANXA1-DMSO（实验对照组）和A549-si-ANXA1/ANXA1（空白对照组）。利用western blot方法检测细胞中IKKγ和P-IKKγ的表达，qRT-PCR方法检测miR-26a的表达情况。　　5）ANXA1-NF-κB-miR-26a通路对非小细胞肺癌侵袭和迁移能力的影响抑制ANXA1表达的细胞：实验分为三组：ANXA1 siRNA-IKK-16（实验组）、ANXA1 siRNA-SN50（实验组）和ANXA1 siRNA（空白对照组）。通过Transwell和Boyden实验检测分别抑制细胞中IKKγ和p65活性后对非小细胞肺癌细胞侵袭及迁移的影响。　　过表达ANXA1的细胞：实验分为三组：A549-si-ANXA1/ANXA1-IKK-16（实验组）、A549-si-ANXA1/ANXA1-SN50（实验组）和A549-si-ANXA1/ANXA1（空白对照组）。通过Transwell和Boyden实验检测分别抑制细胞中IKKγ和p65活性后对非小细胞肺癌细胞侵袭及迁移的影响。　　结果:　　一、非小细胞肺癌中ANXA1表达水平的检测　　1、非小细胞肺癌组织中ANXA1表达水平的检测Western blot和qRT-PCR结果显示在11对新鲜配对的肿瘤组织中ANXA1 mRNA和蛋白表达水平高于相配对的癌旁正常组织。　　2、非小细胞肺癌细胞株中ANXA1表达水平的检测Western blot和qRT-PCR方法检测6种非小细胞肺癌细胞株ANXA1 mRNA和蛋白的表达情况，结果显示，以16HBE为对照，ANXA1在A549、H460、H1299、95D和PAa细胞中表达明显上调，H520细胞中表达明显下调。　　二、ANXA1对非小细胞肺癌生物学行为的影响　　1、构建ANXA1过表达和干扰病毒载体，建立稳定表达细胞株利用分子克隆技术构建ANXA1干扰和过表达病毒载体，测序结果显示构建成功；将ANXA1过表达和干扰病毒载体分别感染非小细胞肺癌细胞株，western blot检测结果显示，成功建立稳定干扰和过表达ANXA1的细胞株，用于下一步实验。　　2、干扰ANXA1表达对非小细胞肺癌细胞生物学行为的影响　　1）LV-ANXA1-RNAi和LV-ANXA1-RNAi-con感染A549细胞，CCK-8细胞增殖实验结果显示，与A549-ANXA1 siRNA-con（空载体组）和A549（空白对照组）相比，干扰ANXA1（实验组）细胞生长能力明显减弱(P<0.05)，空载体组和空白对照组组间相比无明显差异(P>0.05)。　　2）LV-ANXA1-RNAi和LV-ANXA1-RNAi-con感染H1299细胞，CCK-8细胞增殖实验结果显示，与H1299-ANXA1 siRNA-con（空载体组）和H1299（空白对照组）相比，干扰ANXA1（实验组）细胞生长能力明显减弱(P<0.05)，空载体组和空白对照组组间相比无明显差异(P>0.05)。以上结果说明干扰ANXA1表达抑制非小细胞肺癌细胞的增殖。　　3）细胞划痕、Transwell及Boyden实验结果显示，与A549-ANXA1 siRNA-con（空载体组）和A549（空白对照组）相比，干扰ANXA1（实验组）细胞侵袭和迁移能力明显被抑制(P<0.05)，空载体组和空白对照组组间相比无明显差异(P>0.05)。　　4）细胞划痕、Transwell及Boyden实验结果显示，与H1299-ANXA1 siRNA-con（空载体组）和H1299（空白对照组）相比，干扰ANXA1（实验组）细胞侵袭和迁移能力明显被抑制(P<0.05)，空载体组和空白对照组组间相比无明显差异(P>0.05)，以上结果说明干扰ANXA1表达明显抑制非小细胞肺癌细胞的侵袭和迁移。　　3、过表达ANXA1对非小细胞肺癌细胞生物学行为的影响1）将慢病毒LV-ANXA1和LV-ANXA1-con分别感染ANXA1 siRNA细胞， CCK-8细胞增殖实验结果显示，与A549-si-ANXA1/ANXA1-con（空载体组）和ANXA1 siRNA（空白对照组）相比，干扰后再过表达ANXA1（实验组）细胞生长能力显著增强(P<0.01)，空载体组和空白对照组组间相比无明显差异(P>0.05)，说明过表达ANXA1促进非小细胞肺癌细胞的增殖。　　2）细胞划痕、Transwell和Boyden实验结果显示，与A549-si-ANXA1/ANXA1-con（空载体组）和ANXA1 siRNA（空白对照组）相比，干扰后再过表达ANXA1（实验组）细胞侵袭及转移能力明显增强(P<0.05)，空载体组和空白对照组组间相比无明显差异(P>0.05)，表明过表达ANXA1促进非小细胞肺癌细胞的侵袭和迁移。　　三、p65对miR-26a表达调控的研究　　1、非小细胞肺癌组织中p65总蛋白表达水平的检测Western blot和qRT-PCR方法检测10对新鲜配对非小细胞肺癌组织中p65总蛋白的表达，结果显示，非小细胞肺癌组织中p65总蛋白的表达高于配对癌旁正常组织。　　2、p65对miR-26a表达的调控作用　　Western blot和qRT-PCR结果显示，与A549-DMSO（实验对照组）和A549（空白对照组）为参照，抑制A549细胞中p65活性后，胞浆中总p65表达无明显变化(P>0.05)，胞核中P-p65表达明显下调(P<0.05)，miR-26a的表达明显升高(P<0.05)，实验对照组和空白对照组组间比较无明显差异(P>0.05)。　　以A549-si-ANXA1/ANXA1-DMSO（实验对照组）和A549-si-ANXA1/ANXA1（空白对照组）为对照，干扰后再过表达ANXA1(A549-si-ANXA1/ANXA1-SN50)（实验组）胞浆中总p65表达无明显变化(P>0.05)，胞核中P-p65表达明显下调(P<0.05)，miR-26a的表达明显升高(P<0.05)，实验对照组和空白对照组组间比较无明显差异(P>0.05)。　　四、ANXA1-NF-κB-miR-26a通路对非小细胞肺癌侵袭和迁移能力的影响　　1、ANXA1对NF-κB通路的调节作用　　1）干扰ANXA1表达对NF-κB信号通路分子表达的影响Western blot检测结果显示，以A549-ANXA1 siRNA-con（空载体组）和A549（空白对照组）为对照，干扰ANXA1（实验组）细胞中总IKKα/β和P-IKKα/β无明显变化(P>0.05)，P-IKKγ、P-IKBα、P-p65的表达均显著下降(P<0.05)，而胞浆中总的IKKγ、IKBα、p65的表达无明显变化(P>0.05)，空载体组和空白对照组组间比较无明显差异(P>0.05)。　　2）干扰后再过表达ANXA1对NF-κB信号通路分子表达的影响Western blot检测结果显示，以A549-si-ANXA1/ANXA1-con（空载体组）和ANXA1 siRNA（空白对照组）为参照，干扰后再过表达ANXA1（实验组）细胞胞浆总IKKα/β和P-IKKα/β无明显变化(P>0.05)，P-IKKγ、P-IKBα、P-p65的表达均显著增加(P<0.05)，胞浆中总的IKKγ、IKBα、p65的表达未发生明显变化(P>0.05)，空载体组和空白对照组组间比较无统计学意义(P<0.05)。　　2、ANXA1对miR-26a表达的影响　　1）qRT-PCR检测结果显示，以A549-ANXA1 siRNA-con（空载体组）和A549（空白对照组）为对照，干扰ANXA1（实验组）细胞中miR-26a表达明显上调(P<0.05)，空载体组和空白对照组组间比较无明显差异(P>0.05)。　　2）以A549-si-ANXA1/ANXA1-con（空载体组）和ANXA1 siRNA（空白对照组）为参照，干扰后再过表达ANXA1（实验组）细胞中miR-26a表达明显下降(P<0.05)，空载体组和空白对照组组间比较无统计学意义(P>0.05)。　　3、非小细胞肺癌细胞株中ANXA1、p65、miR-26a三者的表达相关性Pearson相关分析结果显示，在7种非小细胞肺癌细胞株中ANXA1与miR-26a（r=-0.81，P=0.0272）和p65与miR-26a（r=-0.793，P=0.0333）的表达水平呈负相关关系；ANXA1与p65（r=0.825，P=0.0224）的表达水平呈正相关关系。　　4、IKKγ在ANXA1调控miR-26a表达中的作用　　通过核浆蛋白分离、western blot和qRT-PCR方法检测结果显示，以A549-DMSO（实验对照组）和A549（空白对照组）为参照，抑制A549细胞中IKKγ活性后，胞浆中总的IKKγ、IKBα、p65的表达无明显变化(P>0.05)，P-IKKγ、P-IKBα、P-p65的表达显著下降(P<0.05)，miR-26a表达明显上调(P<0.05)，实验对照组和空白对照组组间比较无明显差异(P>0.05)。同样，在干扰后再过表达ANXA1的细胞中，以A549-si-ANXA1/ANXA1-DMSO（实验对照组）和A549-si-ANXA1/ANXA1（空白对照组）组为对照，干扰后再过表达ANXA1的细胞中抑制IKKγ活性后，胞浆中总的IKKγ、IKBα、p65的表达无明显变化(P>0.05)，P-IKKγ、P-IKBα、P-p65的表达显著下降(P<0.05)，miR-26a表达明显增加(P<0.05)，实验对照组和空白对照组组间比较无明显差异(P>0.05)。　　5、ANXA1-NF-κB-miR-26a通路对非小细胞肺癌细胞侵袭和迁移的影响Transwell和Boyden实验结果显示：在干扰ANXA1细胞中，与ANXA1 siRNA（空白对照组）相比，ANXA1 siRNA-IKK-16（实验组）和ANXA1 siRNA-SN50（实验组）细胞侵袭和迁移的细胞数量较空白对照组显著减少(P<0.05)。在干扰后再过表达ANXA1细胞中，以A549-si-ANXA1/ANXA1（干扰后再过表达ANXA1细胞）（空白对照组）为参照， A549-si-ANXA1/ANXA1-IKK-16（实验组）和siRNA-LV-ANXA1-SN50（实验组）细胞侵袭(P<0.05)和迁移(P<0.01)能力较空白对照组相比明显减弱。　　结论:　　1、ANXA1在非小细胞肺癌中高表达，可促进非小细胞肺癌细胞的增殖、侵袭和迁移，发挥癌基因作用。　　2、ANXA1通过与IKKγ作用激活NF-κB经典信号通路。　　3、ANXA1通过与IKKγ作用激活NF-κB通路调控miR-26a的表达，进而促进非小细胞肺癌的侵袭和迁移。